中藥有效成分對(duì)維氏氣單胞菌毒力基因表達(dá)的影響.pdf

1、近幾年，由細(xì)菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病給漁業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，由維氏氣單胞菌引發(fā)的致病情況呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。隨著抗生素的頻繁使用，致病菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了耐藥性。目前，使用中藥防治細(xì)菌性疾病已得到越來(lái)越多的認(rèn)可，但是中藥成分復(fù)雜，究竟是哪種成分能夠有效抑制甚至殺死致病菌，對(duì)其作用機(jī)理的研究卻不多，細(xì)菌毒力基因的作用及研究更少。因此，本試驗(yàn)篩選幾種抑菌效果較好的中藥有效成分作用維氏氣單胞菌，以期從毒力基因的表達(dá)水平變化，來(lái)解釋中藥有效成分的作用

2、機(jī)理，為中藥有效成分應(yīng)用水產(chǎn)動(dòng)物疾病的防治提供理論基礎(chǔ)。
　　 試驗(yàn)Ⅰ:維氏氣單胞菌的分離鑒定
　　 從發(fā)病的烏鱧體內(nèi)分離到一株優(yōu)勢(shì)菌，命名為swurc，經(jīng)人工感染后證實(shí)其對(duì)鯽魚有相同的病兆現(xiàn)象，且有較強(qiáng)的致病性，本試驗(yàn)以分子鑒定16S rRNA序列為主，結(jié)合分離株swurc的生理生化鑒定結(jié)果，確定病原菌為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明該菌16S rRNA序列與同源性較高的前

3、40位的菌株均為維氏氣單胞菌(A.veronii)，同源性在99％以上。
　　 試驗(yàn)Ⅱ:維氏氣單胞菌毒力基因氣溶素Aero與外膜蛋白OMP的克隆及其序列分析
　　 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)引用氣單胞菌氣溶素Aero與外膜蛋白OMP毒力基因引物序列，以維氏氣單胞菌菌株swurc的基因組DNA為擴(kuò)增模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，分別克隆到pMD19-T載體上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，篩選陽(yáng)性克隆鑒定，送檢測(cè)序，然后對(duì)擴(kuò)增得到的基因片段序列進(jìn)行同源性比

4、對(duì)，結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增得到氣溶素Aero基因417bp，外膜蛋白OMP基因1017bp。克隆得到的Aero基因蛋白序列與相關(guān)GenBank報(bào)道的Aero基因蛋白序列同源性最高達(dá)到99％，OMP基因蛋白序列與相關(guān)GenBank報(bào)道的OMP基因蛋白序列同源性最高達(dá)到99％。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank公布的氣單胞菌Aero和OMP毒力基因序列在保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，能夠擴(kuò)增出本試驗(yàn)維氏氣單胞菌菌株的毒力基因片段，表明氣單胞菌屬相同的毒力基因具有較高

5、的同源性。
　　 試驗(yàn)Ⅲ:維氏氣單胞菌的藥敏試驗(yàn)
　　 試驗(yàn)選取12種中藥有效成分（槲皮素、苦參堿、黃岑苷、虎杖苷、山奈酚、鹽酸小檗胺、沒(méi)食子酸、橙皮苷、大黃素、木犀草素、大黃素甲醚、蘆丁對(duì)照品），采用平板挖洞法對(duì)維氏氣單胞菌菌株swurc進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。然后采用二倍稀釋法測(cè)定各有效成分對(duì)維氏氣單胞菌菌株swurc的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果表明:沒(méi)食子酸表現(xiàn)出高度敏感性，槲皮素、大黃素、黃芩苷和

6、山奈酚表現(xiàn)出中度敏感性，其余中藥有效成分表現(xiàn)出低度敏感性。槲皮素對(duì)維氏氣單胞菌MIC最小，為0.125mg/mL，MBC為0.25 mg/mL;沒(méi)食子酸和黃芩苷MIC和MBC均為0.25 mg/mL;大黃素MIC為0.25 mg/mL，MBC為0.5 mg/mL。
　　 試驗(yàn)Ⅳ:體外中藥有效成分對(duì)維氏氣單胞菌毒力基因表達(dá)的影響
　　 從維氏氣單胞菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果中選取抑菌效果較好的沒(méi)食子酸、槲皮素、黃芩苷和大黃素4種中藥

7、有效成分，分別以其各自的MIC作為中間濃度，設(shè)定3個(gè)濃度梯度作用維氏氣單胞菌。提取維氏氣單胞菌總RNA，反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行毒力基因的PCR擴(kuò)增，并以16S rRNA作為內(nèi)參，分析中藥有效成分對(duì)維氏氣單胞菌毒力基因表達(dá)水平的影響。結(jié)果沒(méi)食子酸、黃芩苷作用維氏氣單胞菌其毒力基因Aero與OMP的0.25mg/mL組與0.5mg/mL組同空白組相比均表現(xiàn)為顯著性差異(P＜0.05);槲皮素作用其毒力基因Aero與OMP的0.25mg/mL組同空白組、

8、0.0625mg/mL組和0.125mg/mL組相比均表現(xiàn)為顯著性差異（P＜0.05）;而大黃素作用其毒力基因Aero的0.5mg/mL組同空白組、0.125mg/mL組和0.25mg/mL組相比表現(xiàn)為顯著性差異(P＜0.05)，其毒力基因OMP的0.25mg/mL組與0.5mg/mL組同空白組相比差異顯著(P＜0.05)。表明隨著中藥有效成分濃度的增加，毒力基因表現(xiàn)出不同程度的依賴性遞減表達(dá)，說(shuō)明中藥有效成分能夠抑制維氏氣單胞菌毒力基

9、因Aero與OMP的表達(dá)。
　　 試驗(yàn)V:魚體內(nèi)中藥有效成分對(duì)維氏氣單胞菌毒力基因表達(dá)的影響
　　 選擇沒(méi)食子酸、槲皮素、黃芩苷和大黃素4種中藥有效成分，分別以其MIC作為中間濃度，設(shè)定3個(gè)濃度梯度拌餌投喂鯽魚。一周后，以維氏氣單胞菌攻毒，每尾鯽魚注射維氏氣單胞菌應(yīng)用菌液108cfu/mL0.2mL，一周后解剖頻臨死亡的鯽魚，取病兆部位肝胰臟提取細(xì)菌總RNA，反轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增毒力基因Aero與OMP，結(jié)果沒(méi)有擴(kuò)增出毒力