番茄抗病基因Sw-5b介導(dǎo)的抗TSWV轉(zhuǎn)基因本氏煙的研究.pdf

1、番茄斑萎病是一類分布廣泛，在許多植物上引起嚴(yán)重癥狀的病害，由布尼亞病毒科(Bunuyaviridae)番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)典型成員番茄斑萎病毒(Tomatospotted wilt virus，TSWV)系統(tǒng)侵染引起。Sw-5b是一個(gè)有CC-（NB-ARC）-LRR結(jié)構(gòu)的抗病基因，從秘魯番茄中克隆獲得，該抗病基因的番茄可以有效限制TSWV在番茄中的傳播，并有輕微的過(guò)敏性反應(yīng)表現(xiàn)。
　　本研究采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將番茄抗

2、病基因Sw-5b轉(zhuǎn)入了本氏煙中。首先構(gòu)建了含番茄抗病基因Sw-5b的載體p2300-Sw-5b，用葉盤(pán)法通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化本氏煙，經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因本氏煙再生植株，初步進(jìn)行了分子檢測(cè)和抗病性鑒定，結(jié)果如下:
　　Sw-5b農(nóng)桿茸表達(dá)裁體的構(gòu)建:在本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了特異性的引物，從抗病番茄中克隆了3.7kb的Sw-5b基因，通過(guò)SmalⅠ和PstⅠ位點(diǎn)雙酶切插入改造過(guò)的農(nóng)桿菌表達(dá)載體p2300（將原來(lái)的35S啟動(dòng)子替換為SW-5b

3、的native啟動(dòng)子），構(gòu)好的載體經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101，該農(nóng)桿菌與舍有p2300-Nsm（表達(dá)TSWV NSm蛋白）的農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)本氏煙葉片時(shí)，能夠引起超敏反應(yīng)(HypersensitiveResponse，HR)，表明載體構(gòu)建成功。
　　Sw-5b轉(zhuǎn)基因本氏煙的研究:我們將上述步驟構(gòu)建的p2300-Sw-5b表達(dá)載體使用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化至本氏煙，通過(guò)T1代和性狀分離比判斷能發(fā)生HR的轉(zhuǎn)基因煙草都是純舍子。使用TSW