一個中國漢族早老癥家系致病基因的確定和RNA-Seq分析.pdf

1、本文對一個中國漢族早老癥家系致病基因的確定和RNA-Seq進(jìn)行了分析。本研究分為三個部分：
　　第一章：早老癥患者臨床特征分析及致病基因檢測。
　　目的：通過收集早老癥家系中患兒的臨床資料及血液檢測指標(biāo)，分析早老癥患兒的臨床特征；通過對早老癥家系中3名患兒及其親屬進(jìn)行遺傳分析和基因檢測，明確早老癥家系中患兒致病基因。
　　方法：收集早老癥家系3名患兒及其父母的臨床資料及影像學(xué)資料。同時獲取3名患兒及其父母外周血，一部分

2、進(jìn)行血常規(guī)、血生化、自身抗體等檢測；一部分進(jìn)行染色體G-顯帶分析。家系全部成員收集外周血進(jìn)行LMNA基因外顯子測序分析。
　　結(jié)果：家系中3名患兒均表現(xiàn)出典型的早老表型，同時3名患兒血脂、堿性磷酸酶、血清磷、血小板均升高；影像學(xué)上見小下頜、梨形胸、鎖骨
　　缺失、脊柱畸形等；染色體G帶未見異常，這些均符合早老癥患兒特征。LMNA基因外顯子測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)家系中患者父母為9號外顯子R527C雜合突變，而家系中3名患兒為R527C純

3、合突變。
　　結(jié)論：根據(jù)臨床特征結(jié)合基因檢測結(jié)果診斷該家系所患疾病為兒童早老癥；確定該早老癥家系為LMNA基因R527C純合突變所致。
　　第二章：早老癥患者外周血白細(xì)胞RNA-seq分析。
　　目的：通過RNA-Seq技術(shù)分析早老癥患兒差異表達(dá)基因，分析其致病的分子機(jī)制。
　　方法：獲取家系中3名早老癥患兒外周血，分離白細(xì)胞作為病例組；獲取4名健康同齡兒童外周血，分離白細(xì)胞后將4名健康兒童白細(xì)胞混在一起作為一個

4、正常對照組。病例組和對照組白細(xì)胞一起寄送深圳華大基因公司進(jìn)行RNA提取及RNA-Seq分析。
　　結(jié)果：樣本RNA質(zhì)量及RNA-seq測序結(jié)果均合格。通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)3名早老癥患兒（按照年齡從小到大排列）與健康對照組比較分別有712，1175，1215個基因差異表達(dá)（p＜0.05）。對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)有絲分裂過程及風(fēng)濕通路、細(xì)胞周期通路等相關(guān)基因表達(dá)差異顯著。
　　結(jié)論：RNA-Seq分析獲得

5、的早老癥差異表達(dá)基因與文獻(xiàn)報道的基因芯片分析結(jié)果一致；RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)早老癥患兒存在細(xì)胞周期調(diào)控基因及風(fēng)濕通路激活相關(guān)基因的表達(dá)量改變。
　　第三章：早老癥患者差異表達(dá)基因的qPCR驗證和免疫組織化學(xué)分析。
　　目的：通過qPCR及免疫組織化學(xué)方法檢測早老癥患兒差異基因表達(dá)情況。
　　方法：獲取3名早老癥患兒及11名健康同齡兒童的外周血，提取RNA，利用qPCR方法驗證風(fēng)濕通路基因CD80、FOS、IL8、CXC

6、L1高表達(dá)。獲取早老癥家系先證者及5名系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者、12名系統(tǒng)性硬皮病患者、9名局限性硬皮病患者皮損組織切片及8名健康體檢者皮膚組織切片，運用免疫組織化學(xué)方法檢測不同組皮膚中FOS的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)早老癥患兒外周血白細(xì)胞CD80、FOS、IL8、CXCL1表達(dá)量均較健康同齡兒童高，與RNA-Seq結(jié)果一致，除CD80外，其余三個基因表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05。免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)早老癥患兒皮損