HBV誘導(dǎo)IL-23、IP-10表達對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響及其機制研究.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒（HBV）引起的慢性感染是肝癌發(fā)生的主要危險因素。文獻報道及我們前期研究證明HBV感染可誘導(dǎo)IL-23和IP-10的表達，且在HBV感染的病人血清以及組織中呈高表達。已有報道表明某些細胞因子，如IL-23能促進細胞的增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移等，發(fā)揮著促腫瘤的作用；IL-23及IP-10等細胞因子亦能促進T細胞的浸潤，發(fā)揮免疫應(yīng)答功能，抑制腫瘤生長。HNF4α是肝細胞分化因子，在肝臟、腎以及小腸的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。而且H

2、NF4α與炎癥密切相關(guān)，是諸多細胞因子的靶分子，IL-1、IL-6及TNF等細胞因子對其表達以及活性均有影響。IL-23或IP-10是否在HBV感染引起的慢性炎癥中影響HNF4α的表達，以及對肝癌細胞的生物學(xué)行為的影響及其作用機制仍不清楚。本研究旨在探討HBV誘導(dǎo)IL-23、IP-10及其受體在不同肝細胞中的表達對肝癌細胞的生物學(xué)行為的影響及其機制，為以其為靶點的腫瘤干預(yù)策略提供實驗依據(jù)。
　　方法：①HepG2和HepG2.21

3、5中細胞炎性因子（IL-1β、IL-6、TNF、IL-23、HMGB1、IL-17以及IL-33）的表達采用RT-PCR檢測。②不同肝細胞系中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78、肝細胞分化相關(guān)分子HNF4α以及HNF4α靶基因G6Pase表達的檢測：肝細胞系LO2、HepG2、Huh-7以及HepG2.215中GRP78、HNF4α和G6Pase mRNA水平的表達采用RT-PCR檢測；肝細胞系LO2、HepG2、Huh-7以及HepG2.215

4、中GRP78和HNF4α蛋白水平的表達采用Western Blot檢測。③肝癌細胞HBV瞬時轉(zhuǎn)染后GRP78以及HNF4α表達的檢測：HepG2瞬時轉(zhuǎn)染HBV24h、48h以及72h后GRP78和HNF4αmRNA的表達采用RT-PCR檢測；HepG2和Huh-7瞬時轉(zhuǎn)染HBV72h后GRP78和HNF4α蛋白水平的表達采用Western Blot檢測。④檢測IL-23受體（IL-23R）以及IP-10受體（CXCR3）在肝癌細胞系中的

5、表達：肝癌細胞系HepG2、Huh-7和HepG2.215中IL-23R的表達采用RT-PCR檢測；HepG2和HepG2.215細胞中IL-23R以及CXCR3的表達采用流式細胞術(shù)（FCM）檢測；HepG2、Huh-7和HepG2.215細胞中IL-23R以及CXCR3的表達采用免疫熒光檢測。⑤肝癌組織標(biāo)本中CXCR3的表達采用細胞免疫組化法（組織切片）檢測。⑥細胞因子對肝癌細胞生物學(xué)影響實驗：細胞增殖實驗：不同濃度IL-23或IP-

6、10（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）刺激細胞48h后，CCK-8檢測細胞增殖率；細胞周期實驗：不同濃度IL-23或IP-10（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）刺激細胞24h后，固定過夜，PI染色后流式細胞術(shù)（FCM）檢測細胞周期變化；細胞凋亡實驗：無血清狀況下加入不同濃度的IL-23或IP-10（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng

7、/ml，40ng/ml）培養(yǎng)細胞48h，Annexin V-FITC和PI染色，F(xiàn)CM檢測細胞凋亡；細胞克隆實驗：細胞接種至六孔板，IL-23（0ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）或IP-10（0ng/ml，10ng/ml，40ng/ml）培養(yǎng)細胞5~7天，結(jié)晶紫染色；細胞劃痕實驗：細胞單層鋪滿孔板，刮去部分細胞，加入不同濃度IL-23（0ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）或IP-10（0ng/ml，10ng/ml，

8、40ng/ml）培養(yǎng)，觀察劃痕處細胞生長情況；細胞趨化侵襲實驗：用Transwell法檢測不同濃度的IP-10（0ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）處理后肝癌細胞的趨化能力；采用Transwell檢測不同濃度IL-23或IP-10（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）處理后肝癌細胞的侵襲能力。⑦IL-23或IP-10作用于肝癌細胞系后HNF4α表達的檢測：不同比例的Hep

9、G2.215上清加或不加IP-10抗體（0μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml）培養(yǎng)肝癌細胞24h后，HepG2細胞中HNF4α的表達采用Western Blot檢測；不同濃度IL-23或IP-10（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）處理24h后，肝癌細胞系中HNF4α的表達采用Western Blot檢測。⑧IL-23或IP-10作用于肝癌細胞系后相關(guān)基因及C

10、D133表達的檢測：不同濃度IL-23或IP-10（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）處理24h后肝癌細胞系中相關(guān)基因的表達采用Realtime PCR檢測；不同濃度IL-23或IP-10（0ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）處理24h后肝癌細胞系中CD133的表達采用流式細胞術(shù)（FCM）檢測。⑨不同濃度IL-23或IP-10（0ng/ml，5ng/ml，

11、10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml）刺激肝癌細胞24h后，STAT3蛋白的磷酸化形式p-STAT3、AKT蛋白的磷酸化形式p-AKT、HNF4α、E-cadherin以及GRP78的表達采用Western Blot檢測。
　　結(jié)果：⑴肝癌細胞系及組織中細胞因子及其受體的表達：肝癌細胞系HepG2中所檢測的細胞因子低表達，HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細胞系HepG2.215中炎性因子TNF、IL-23、HMGB1以及IL-1β表

12、達增加，以IL-23的表達增加最為明顯；肝癌細胞系中均具有IL-23R以及CXCR3的表達；⑵不同肝細胞系中HNF4α、GRP78以及G6Pase的表達：實驗結(jié)果表明，肝癌細胞系中均有HNF4α、GRP78以及G6Pase mRNA的表達，并且在HBV穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2.215中其表達則降低；HepG2.215細胞中GRP78蛋白的表達亦降低，HNF4α蛋白的表達明顯降低；肝癌細胞瞬時轉(zhuǎn)染HBV24h、48h以及72h時GRP

13、78和HNF4α的表達：結(jié)果表明瞬時轉(zhuǎn)染HBV24h、48h以及72h后，GRP78和HNF4αmRNA的表達變化不明顯，而HBV瞬轉(zhuǎn)72h后，GRP78蛋白水平的表達降低，HNF4α蛋白水平的表達顯著降低；⑶IL-23對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響：結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的升高IL-23促進細胞增殖、細胞S期阻滯、細胞修復(fù)、細胞克隆形成以及侵襲轉(zhuǎn)移，減少細胞凋亡，當(dāng)濃度達到40ng/ml時，其作用逐漸減弱；⑷IP-10對肝癌細

14、胞生物學(xué)行為的影響：在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的升高IP-10亦能促進細胞增殖和細胞S期阻滯，減少細胞凋亡；細胞修復(fù)、細胞克隆形成、細胞趨化以及侵襲轉(zhuǎn)移能力增強，且具有一定的濃度依賴性；但當(dāng)濃度達到40ng/ml時，其作用減弱；⑸IL-23對HNF4α、GRP78、Bcl-2、CD133以及MMP9表達的影響：在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著IL-23濃度的升高，HNF4α蛋白表達降低，GRP78蛋白表達增加但沒有統(tǒng)計學(xué)差異；抗凋亡基因Bcl-2

15、、干細胞化標(biāo)志CD133以及侵襲相關(guān)基因MMP9等mRNA表達上調(diào)；在20ng/ml時這種作用最為明顯，40ng/ml時其上調(diào)作用下降；⑹IP-10對HNF4α、GRP78、Bcl-2、CD133以及MMP9表達的影響：在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著IP-10濃度升高，HNF4α的蛋白表達降低，但對GRP78的表達具有促進作用，在40ng/ml時其促進作用較為明顯；抗凋亡基因BCL-2、干細胞標(biāo)志CD133以及侵襲相關(guān)基因MMP9等mRNA表

16、達上調(diào)，在10ng/ml時這種作用最為明顯，40ng/ml時其作用降低；⑺不同濃度IL-23和IP-10對STAT3以及AKT活化的影響不同，IL-23在一定濃度范圍內(nèi)，促進STAT3活化，隨著濃度升高，對STAT3活化的促進作用減弱，5ng/ml時促進作用最為明顯，而40ng/ml時對其活性具有一定的抑制作用；IL-23對E-cadherin的表達具有一定的抑制作用，隨著IL-23濃度的升高E-cadherin的表達降低；IP-10在

17、一定的濃度范圍內(nèi)促進AKT活化，10ng/ml時最為明顯，隨著濃度的進一步升高，AKT活化降低；IP-10在一定的濃度范圍內(nèi)對E-cadherin的表達具有抑制作用，10ng/ml時抑制作用最為明顯。
　　結(jié)論：①HBV可誘導(dǎo)炎性因子IP-10以及IL-23表達，抑制HNF4α和GRP78的表達，IL-23R以及IP-10的受體（CXCR3）在肝癌細胞中均有表達，提示IL-23和IP-10分別可與肝癌細胞系表面相應(yīng)受體結(jié)合從而發(fā)揮

18、不同的生物學(xué)效應(yīng)；②證明在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，IL-23和IP-10促進細胞增殖、細胞修復(fù)、細胞克隆形成以及侵襲轉(zhuǎn)移，同時也能上調(diào)BCL-2、CD133以及MMP9等相關(guān)基因的表達，降低HNF4α的表達，提示IL-23以及IP-10具有促進肝癌的作用，其作用可能與HNF4α的表達降低有關(guān)；③IL-23在一定濃度范圍內(nèi)，促進STAT3活化，具有濃度依賴性，并抑制HNF4α以及E-cadherin的表達；④IP-10在一定的濃