乙酰乳酸脫羧酶體外重組表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)分析.pdf

1、碩士學(xué)位論文乙酰乳酸脫羧酶體外重組表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)分析RecombinantExpressionandEnzymaticCharacterizationofAcetolactateDecarboxylase／nvitro學(xué)號：21218124完成日期：2Ql51Q魚!Q窆大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要乙偶姻及其氧化還原產(chǎn)物雙乙酰、2，3丁二醇均是重要的四碳平臺化合物，在食品

2、、制藥、燃料和航天等領(lǐng)域具有非常重要的用途。在細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)這三種四碳平臺化合物途徑中，乙酰乳酸脫羧酶(Acetolactatedecarboxylase，ALDC)是控制0【一乙酰乳酸代謝流的關(guān)鍵酶，它能催化外消旋的a一乙酰乳酸分子發(fā)生脫羧反應(yīng)，生成單一手性產(chǎn)物(R)一乙偶姻。多數(shù)微生物體具有生產(chǎn)ALDC的能力，但是不同來源的ALDC在結(jié)構(gòu)與酶學(xué)性質(zhì)方面有很大差異。Enterobacteraerogenes和Enterobactercl

3、oacae是常見的具有2，3一丁二醇生產(chǎn)能力的菌株；然而一株來源于近海污泥高產(chǎn)乙偶姻(4163g／L)的菌株BacillussubtilisDL01，在發(fā)酵過程中檢測不到副產(chǎn)物雙乙酰和2，3一丁二醇的產(chǎn)生。因此，本論文以上述三株細(xì)菌為出發(fā)菌株，通過基因克隆和重組表達(dá)的三種ALDC，研究ALDC結(jié)構(gòu)與酶活性關(guān)系。論文研究將不同來源ALDC的編碼基因克隆、重組到EcoliBL21中。經(jīng)IPTG在37oC誘導(dǎo)后重組基因獲得可溶性表達(dá)。通過離子

4、交換層析和凝膠層析兩個步驟成功獲得了電泳純的ALDC，SDSPAGE結(jié)果顯示三種ALDC分子量大小均為30kDa左右。生物信息學(xué)分析表明，ALDC—BS與另外兩者的氨基酸序列相似度僅有40％；分子對接結(jié)果表明三種ALDC更傾向于直接催化(S)型底物反應(yīng)，其中ALDCEc與底物的結(jié)合能最小，而ALDCBs的最大，說明ALDCEc較ALDCBs表現(xiàn)出更好的底物親和性。根據(jù)ALDC催化反應(yīng)所發(fā)生的特殊手性變化，采用圓二色光譜技術(shù)測定三種ALD

5、C的活性，結(jié)果表明，ALDCBs的比活力為185326U／mg，約是ALDCEc的18倍和ALDCEa的22倍。相同pH條件下三者活性有所差異，且部分二價金屬離子能對ALDC產(chǎn)生激活作用。酶反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)顯示ALDCBs的‰值為2094mM；而ALDCEc與ALDCEa的‰值接近，分別為1220與1483mM，與ALDCBS相比，ALDCEc與ALDCEa表現(xiàn)出更好的底物親和性；ALDCBs的‰。t值為221S～，大于ALDCEC的‰a