缺氧條件下核呼吸因子-1對大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能的影響.pdf

1、目的：
　　為了研究NRF-1基因?qū)Υ笫笮募〖?xì)胞（H9c2）線粒體功能代謝的影響，我們建立1％O2+5%CO2的物理缺氧模型，觀察NRF-1基因能否改善大鼠心肌細(xì)胞在缺氧條件下的生長狀態(tài)及能量代謝水平，旨在為心力衰竭的基因治療提供一種新的途徑。
　　方法：
　　1.利用第三代慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建NRF-1過表達(dá)細(xì)胞株（pCDH-NRF）、干擾細(xì)胞株（sh-NRF）和空病毒細(xì)胞株(pCDH-vector)。Western

2、blot法及熒光定量PCR法鑒定NRF-1的表達(dá)水平。
　　2.分別在5%CO2+95%空氣及1%O2+5%CO2條件下培養(yǎng)三組細(xì)胞24h及48h，使用CCK-8法測定三組細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下細(xì)胞活力的變化。
　　3.分別在5%CO2+95%空氣及1%O2+5%CO2條件下培養(yǎng)三組細(xì)胞48h，使用流式細(xì)胞術(shù)測定線粒體膜電位的變化。
　　4.使用細(xì)胞線粒體能量代謝儀檢測各組細(xì)胞在正常和缺氧條件下線粒體的耗氧水平。
　　

3、結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建出NRF-1基因過表達(dá)慢病毒載體，并且熒光定量PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)細(xì)胞株中NRF-1基因表達(dá)水平（4.08±0.3）高于空病毒組細(xì)胞株（1.00±0.15），而干擾組細(xì)胞株中NRF-1基因表達(dá)水平（0.35±0.14）低于空病毒組細(xì)胞株（1.00±0.15）；Western Blot結(jié)果顯示，過表達(dá)細(xì)胞株中NRF-1蛋白表達(dá)水平（5.07±0.63）高于空病毒組細(xì)胞株（3.15±0.59）與干擾組細(xì)胞株（

4、1.66±0.22）。
　　2.在正常條件下培養(yǎng)細(xì)胞24h后，NRF-1過表達(dá)細(xì)胞株、干擾組細(xì)胞株及空病毒組細(xì)胞株OD值分別為1.4365±0.0223、1.5125±0.0543、1.4087±0.0263；而在1%O2+5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞24h后，三組細(xì)胞株細(xì)胞OD值分別為1.4605±0.0413、1.4833±0.1092、1.4365±0.0926，差異變化不明顯。
　　3.在正常條件下培養(yǎng)細(xì)胞48h后，NR

5、F-1過表達(dá)細(xì)胞株、干擾組細(xì)胞株及空病毒組細(xì)胞株OD值分別為1.8649±0.0132、1.8176±.03964、1.7872±0.0062；而在1%O2+5CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞48h后，三組細(xì)胞株細(xì)胞OD值分別為1.5706±0.0251、1.0781±0.0717、1.4038±0.0375，差異變化顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。
　　4.正常條件下NRF-1過表達(dá)組細(xì)胞，NRF-1干擾組細(xì)胞和空病毒組細(xì)胞的線粒體膜

6、電位去極化水平分別為3.1%、5.1%、1.2%，而在1%O2+5%CO2缺氧培養(yǎng)細(xì)胞后，NRF-1過表達(dá)組細(xì)胞，NRF-1干擾組細(xì)胞和空病毒組細(xì)胞線粒體膜電位去極化水平分別為52.7%、28.1%、48.1%，提示NRF-1基因過表達(dá)可以降低缺氧對線粒體膜電位的損傷。
　　5.細(xì)胞在氯化鈷及缺氧處理后，與空病毒組細(xì)胞株相比，NRF-1過表達(dá)組細(xì)胞株的基礎(chǔ)氧耗水平較高，NRF-1干擾組細(xì)胞株的基礎(chǔ)氧耗水平較低。
　　結(jié)論：<