高賴氨酸蛋白基因sb401玉米轉(zhuǎn)基因植株的獲得及檢測(cè)分析.pdf

1、玉米是全世界最重要的糧食、飼料和經(jīng)濟(jì)兼用作物,但是玉米中賴氨酸的含量偏低,每百克含賴氨酸僅2.5g左右,而賴氨酸是人和畜禽必須的營(yíng)養(yǎng),這樣導(dǎo)致玉米中蛋白質(zhì)的利用率很低。增加玉米中蛋白質(zhì)和賴氨酸含量,促進(jìn)人和動(dòng)物對(duì)其蛋白質(zhì)的消化吸收,將提高玉米的利用價(jià)值。
　　 傳統(tǒng)的育種方法在一定程度上提高了賴氨酸的含量,但是提高的潛力不大,費(fèi)時(shí)費(fèi)力?，F(xiàn)代分子生物學(xué)和生物技術(shù)的迅速發(fā)展為使用基因工程技術(shù)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)玉米品質(zhì)的改良帶來(lái)了希望。相對(duì)于

2、其它轉(zhuǎn)化方法來(lái)說(shuō),農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有能夠轉(zhuǎn)移相對(duì)較大的DNA片段、外源基因單拷貝或低拷貝整合、不易引起分子間或分子內(nèi)重排、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點(diǎn),但是其轉(zhuǎn)化效率又受到受體材料、菌液濃度和培養(yǎng)基成分等多種因素的限制,因此建立一套完整的、高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系是非常重要的。
　　 本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有從馬鈴薯花粉中克隆出的高賴氨酸蛋白基因sb401和標(biāo)記基因bar的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)到玉米雜交組合HiⅡA×B中。所用的農(nóng)桿菌菌株為EHA10

3、5,轉(zhuǎn)化材料為由HiⅡA×B的幼胚誘導(dǎo)出的愈傷組織,利用優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化系統(tǒng),確定農(nóng)桿菌的懸浮濃度OD600為0.6～0.8,侵染時(shí)間為5min,侵染后的愈傷組織共培養(yǎng)時(shí)間為3～4d。第一輪篩選所用雙丙胺膦濃度為1.5mg/L,以后篩選濃度均為3m/L,共篩選3～4輪。經(jīng)雙丙胺膦篩選后得到70株轉(zhuǎn)化植株,PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有15株呈剛性。隨機(jī)選取4株P(guān)CR呈陽(yáng)性的植株進(jìn)行PCR-southern檢測(cè),雜交結(jié)果呈陽(yáng)性,證明外源基因已經(jīng)整合到玉米基