棉花與黃萎病菌的分子互作機制研究及GbWRKY1基因的功能鑒定.pdf

1、棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的土傳真菌維管束病害，發(fā)病時會引起棉花葉片失綠變黃，蕾鈴脫落，嚴重時造成棉株死亡，是當前影響棉花生產(chǎn)的主要病害之一。了解棉花與黃萎病菌互作的分子機制，分離抗病相關(guān)基因并利用基因工程技術(shù)對現(xiàn)有陸地棉品種進行抗性改造，已成為當前棉花分子生物學(xué)研究的重點內(nèi)容之一。本研究分別構(gòu)建了抗黃萎病的海島棉‘海7124’接種黃萎病菌后的抑制差減雜交cDNA文庫以及通過大規(guī)模測序的RNA-Seq技術(shù)研究棉花抗黃萎病機制。通過基因

2、表達分析，獲得了大批棉花抗黃萎病相關(guān)基因，并對其中的一個WRKY類轉(zhuǎn)錄因子進行了較為詳細的功能研究，取得的主要結(jié)果如下：
　　 1、構(gòu)建了‘海7124’受黃萎病菌接種后的抑制差減雜交cDNA文庫。對得到的211個差異表達基因功能分類表明主要包括代謝類相關(guān)基因、生物及非生物脅迫反應(yīng)相關(guān)基因、細胞結(jié)構(gòu)以及信號傳導(dǎo)相關(guān)基因等，此外有38%左右的基因未在數(shù)據(jù)庫中得到功能注釋或者功能注釋為未知功能蛋白。一些已知的植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的基因，如

3、PR蛋白、氧爆發(fā)相關(guān)基因以及一些次生代謝相關(guān)的基因等在‘海7124’接種黃萎病菌后受誘導(dǎo)表達明顯。此外一些參與基因表達調(diào)控類基因，如WRKY類轉(zhuǎn)錄因子、MAPK類蛋白激酶等信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因也在棉花抗黃萎病反應(yīng)中差異表達明顯。對這些參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達調(diào)控類基因的詳細分析會將有助于深入了解棉花抗黃萎病病反應(yīng)的分子機制。運用Nothern雜交、RT-PCR和qRT-PCR技術(shù)對分離得到的這些差異表達基因進行驗證，并對它們在一些信號分子，如乙

4、烯、茉莉酸、水楊酸及H2O2等處理后的表達模式進行分析，推測棉花抗黃萎病反應(yīng)所參與的信號路徑。研究發(fā)現(xiàn)，乙烯作為重要的一類抗病信號分子可能在棉花抗黃萎病反應(yīng)中具有重要作用。
　　 2、為了進一步了解棉花抗黃萎病分子機制，我們利用RNA-Seq大規(guī)模測序分析技術(shù)對‘海7124’接種黃萎病菌后4h、12 h、24 h和48 h的不同時間點取樣研究參與棉花抗黃萎病反應(yīng)的基因表達變化。通過數(shù)據(jù)庫篩選及比對分析，共獲得3442個差異表達基

5、因。為了驗證RNA-Seq大規(guī)模測序表達譜分析結(jié)果的準確性，我們選取了不同功能分類、不同表達模式的361個基因進行qRT-PCR分析，結(jié)果表明兩種基因表達模式結(jié)果基本吻合，可對表達譜數(shù)據(jù)進行深入分析。對這些差異表達基因進行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，它們主要參與代謝類相關(guān)途徑和應(yīng)對外界的刺激相關(guān)反應(yīng)。我們對其中參與植物抗病免疫反應(yīng)信號傳導(dǎo)途徑的四類基因包括富含亮氨酸重復(fù)的類受體激酶、激素信號路徑相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因及次生代謝苯丙環(huán)類路徑相關(guān)

6、基因進行了深入分析。研究表明大多數(shù)苯丙環(huán)類物質(zhì)代謝路徑基因都參與了棉花與黃萎病菌的分子互作，并在抗病的‘海7124’和感病的陸地棉品系‘YZ-1’中均受黃萎病菌誘導(dǎo)，但在抗病材料中這些基因被誘導(dǎo)的速度和表達水平都高于感病的陸地棉。酶活檢測的結(jié)果與基因表達分析的結(jié)果相似。采用組織化學(xué)檢測的方法對接菌前后‘海7124’和‘YZ-1’的木質(zhì)素沉積和維管結(jié)構(gòu)的變化進行了比較分析，結(jié)果顯示抗病材料的木質(zhì)素合成增強并在次生壁中的積累和沉積使得維管結(jié)

7、構(gòu)增強了對病原菌的抗性，在海島棉對黃萎病的抗性中起著重要作用。
　　 3、Gb WRKY1是從海島棉中克隆得到的一個受黃萎病菌誘導(dǎo)的WRKY類轉(zhuǎn)錄因子。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，GbWRKY1與擬南芥AtWRKY75相似性較高，同屬于第二類C亞組的WRKY蛋白。通過在擬南芥中超量表達該基因發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥能有效緩解對低磷逆境脅迫的反應(yīng)，包括減少花青素的積累和更多的生物學(xué)產(chǎn)量。研究還表明，在正常條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥的側(cè)根數(shù)增多、磷酸酶活性增

8、強以及植株體內(nèi)無機磷和總磷含量增加。對一系列受磷饑餓誘導(dǎo)基因表達研究發(fā)現(xiàn)，無論是磷轉(zhuǎn)運子基因還是磷饑餓誘導(dǎo)相關(guān)基因，在低磷處理后轉(zhuǎn)基因擬南芥中受誘導(dǎo)程度都低于野生型。由此推論，GbWRKY1可能是緩解磷饑餓脅迫信號傳導(dǎo)中的一個正調(diào)控因子，在擬南芥中該基因的超量表達能在正常條件下模擬磷饑餓的信號，激活植物的低磷反應(yīng)，包括側(cè)根增多，體內(nèi)積累吸收更多的磷，從而能在低磷處理下能夠緩解植物的低磷脅迫反應(yīng)。由于生長素對低磷脅迫反應(yīng)有重要的調(diào)控機制，