姜黃素對腸單層上皮氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用.pdf

1、腸上皮緊密連接(tight junctions，TJ)是腸黏膜屏障功能最重要的解剖學(xué)基礎(chǔ)。TJ形成一道高度選擇性屏障，以防止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)如毒素或細(xì)菌穿過腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)或其他組織器官。TJ的破壞及其所導(dǎo)致的腸黏膜屏障功能受損在一系列腸道受損疾病發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，如炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、梗阻性黃疸(obstructive jaundice，OJ)、急性胰腺炎(acute pa

2、ncreatitis，AP)、酒精性肝病(alcohol-induced liver injury)、壞死性小腸炎和感染性小腸炎等。目前，上皮屏障功能受損的確切機(jī)制尚未完全闡明，但很多研究表明氧化應(yīng)激損傷是破壞TJ影響腸黏膜屏障功能的重要因素。
　　 細(xì)胞正常的有氧代謝持續(xù)產(chǎn)生一定量的過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)，并迅速被抗氧化物酶如溶酶體中的過氧化氫酶、線粒體中的谷胱甘肽過氧化物酶清除。異常情況下H

3、2O2不能被及時(shí)清除會導(dǎo)致細(xì)胞損傷。低微摩爾水平的H2O2與生物系統(tǒng)的相互作用微弱，但是高濃度的H2O2能使糖酵解過程中的3-磷酸甘油醛脫氫酶失活。眾多研究表明H2O2能夠?qū)е履c上皮屏障功能損傷。在Caco-2細(xì)胞單層，H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷破壞上皮屏障功能已經(jīng)被證實(shí)。
　　 血紅素加氧酶-1(heme oxygenase，HO-1)是血紅素分解代謝的限速酶，它通過降解血紅素產(chǎn)生等摩爾的膽綠素(biliverdin)、一氧化

4、碳(carbonmonoxide，CO)和游離鐵(iron)。HO-1為誘導(dǎo)型酶，通常被H2O2、亞鐵血紅素、重金屬離子、細(xì)胞毒素、內(nèi)毒素等具有細(xì)胞損傷作用的致氧化應(yīng)激因素所誘導(dǎo)。目前多項(xiàng)體內(nèi)、外研究證實(shí)誘導(dǎo)HO-1表達(dá)是機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)下重要的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制。姜黃素(curcumin，Cur)是從姜科植物姜黃、莪術(shù)中提取的有效成份，具有抗氧化、抗感染、抗腫瘤、抗病毒等廣泛的藥理作用。Cur己被證實(shí)是一種天然的HO-1強(qiáng)誘導(dǎo)劑。
　

5、　 目的：姜黃素對H2O2介導(dǎo)的腸單層上皮氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。
　　 方法：Caco-2細(xì)胞形成體外腸上皮細(xì)胞屏障模型后，用H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。實(shí)驗(yàn)分為DMSO組，H2O2(500μ,M)組[26]，H2O2+不同濃度Cur組(5，20，80μM)，H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)組(Znpp是HO-1的特異性抑制劑)，共同孵育，分別在1h、3h、6h收集標(biāo)本。收集細(xì)胞培養(yǎng)液檢測LDH、MDA、SO

6、D;測量單層上皮的跨上皮細(xì)胞電阻(trans-epithelialelectrical resistance，TEER)和熒光素鈉透過率；Western blot和免疫熒光化學(xué)方法檢測occludin和ZO-1在細(xì)胞單層的表達(dá)及定位；用Western blot和real-time PCR方法檢測HO-1蛋白及mRNA表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1體外腸上皮細(xì)胞屏障模型制作成功。
　　 2姜黃素對H2O2介導(dǎo)的

7、細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。①姜黃素對H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用：H2O2組較DMSO組LDH活性明顯升高(P＜0.001)，H2O2+不同濃度Cur組均較H2O2組降低（P＜0.05），但H2O2+不同濃度Cur組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。②姜黃素對H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用：H2O2組較DMSO組脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平明顯升高(P＜0.001)，抗氧化物SOD活性明顯降低（P＜0.05）。H2O2+不同

8、濃度Cur組MDA均較H2O2組降低(P＜0.001)，而SOD活性增加(P＜0.05)，H2O2+不同濃度Cur組間MDA水平及SOD活性變化均不明顯（P＞0.05）。
　　 3姜黃素對H2O2介導(dǎo)的腸單層上皮通透性增高的保護(hù)作用。①姜黃素對H2O2介導(dǎo)的腸單層上皮TEER降低的影響：TEER％=TEER/干預(yù)前TEER×100％，用TEER％來表示TEER變化。H2O2組TEER％較DMSO組明顯降低(22.71±3.11％

9、vs99.60±1.30％，P＜0.001)。H2O2+不同濃度Cur組均較H2O2組明顯增高(49.05±13.99％，52.02±10.15％，43.24±12.26％vs22.71±3.11％，P＜0.05)，且H2O2+20μMCur組最佳（P＜0.05）。②姜黃素對H2O2介導(dǎo)的腸單層上皮熒光素鈉透過率增加的影響：H2O2組熒光素鈉透過率較DMSO組明顯升高(32.00±4.97％vs6.10±1.43％，P＜0.001)，H

10、2O2+不同濃度Cur組均較H2O2組明顯降低(20.25±2.63％，12.41±2.19％，19.25±2.81％vs32.00±4.97％，P＜0.05)，且H2O2+20μMCur組降低明顯(P＜0.05)。H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)組較H2O2+20μMCur組的熒光素鈉透過率明顯增加(31.01±2.28％vs12.41±2.19％，P＜0.001)，與H2O2組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

11、　　 4姜黃素對H2O2介導(dǎo)的TJ蛋白o(hù)ccludin和ZO-1破壞的保護(hù)作用。①Westem blot結(jié)果顯示：TJ蛋白o(hù)ccludin表達(dá)水平H2O2組較DMSO組明顯降低(53.67±24.19％vs178.00±29.51％，P＜0.001)，H2O2+不同濃度Cur組均較H2O2組明顯升高(115.00±18.03％，175.67±29.50％，120.67±32.72％vs53.67±24.19％，P＜0.05)，治療組間

12、也存在差別，H2O2+20μMCur組表達(dá)量最高(P＜0.05）。H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)組(80.33±13.05％)較H2O2+20μMCur組的occludin表達(dá)水平明顯降低(P＜0.001)，且與H2O2組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。ZO-1蛋白表達(dá)結(jié)果與occludin變化一致。H2O2組較DMSO組明顯降低(36.00±15.88％vs133.00±26.46％，P＜0.001)，H2O2+不同

13、濃度Cur組均較H2O2組明顯升高(90.33±22.50％，139.67±33.71％，92.00±24.33％vs36.00±15.88％，P＜0.05)，H2O2+20μMCur組表達(dá)量最高(P＜0.05)。H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)組(50.00±15.13％)較H2O2+20μ,MCur組明顯降低(P＜0.001)，與H2O2組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。H2O2+20μMCur干預(yù)細(xì)胞在1h，3h，

14、6h檢測occludin蛋白表達(dá)水平較H2O2組明顯升高(185.00±51.64％，300.67±27.10％，424.33±69.66％vs84.00±19.00％，P＜0.05)，并且呈時(shí)間依賴6h最高(P＜0.05）。ZO-1蛋白表達(dá)與occludin蛋白表達(dá)變化趨勢一致。ZO-1蛋白表達(dá)在1h，3h，6h較H2O2組明顯升高(48.67±20.01％，82.00±12.12％，114.67±20.50％vs15.00±12.5

15、3％，P＜0.05)，6h時(shí)ZO-1蛋白表達(dá)水平較其他時(shí)間組高(P＜0.05）。②免疫熒光結(jié)果顯示：DMSO組occludin蛋白表達(dá)連續(xù)完整，熒光強(qiáng)度高；H2O2組occludin蛋白表達(dá)斷續(xù)不完整，熒光強(qiáng)度弱；H2O2+20μMCur組較H2O2組明顯好轉(zhuǎn)，H2O2+Cur(20μM)+Znpp(20μM)組與H2O2組表現(xiàn)相似。ZO-1變化與Occlludin結(jié)果變化一致。
　　 結(jié)論：應(yīng)用500μMH2O2能夠?qū)е录?xì)胞毒