阿霉素及順鉑誘導(dǎo)的早期凋亡A549細(xì)胞的免疫原性及其發(fā)生機(jī)制.pdf

1、目的:
　　 傳統(tǒng)觀念認(rèn)為化療藥物對(duì)免疫治療有抑制作用,但主要化療藥物如阿霉素等導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡或死亡后能否刺激機(jī)體免疫細(xì)胞,如樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)等從而啟動(dòng)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)并產(chǎn)生殺傷腫瘤效應(yīng),尚需研究。為此,本課題以阿霉素、順鉑誘發(fā)A549細(xì)胞凋亡,并以早期凋亡的A549細(xì)胞為抗原,體外刺激DC,致敏T細(xì)胞,觀察其對(duì)培養(yǎng)的A549細(xì)胞的殺傷效應(yīng),并初步探討其作用機(jī)制,為臨床化療聯(lián)合以樹(shù)突狀細(xì)胞為主的

2、免疫治療新模式的研究和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 用吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)法檢測(cè)經(jīng)阿霉素及順鉑處理后A549細(xì)胞的凋亡率。MTT法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量。DC細(xì)胞的制備:采取外周血經(jīng)密度梯度離心法最終獲得單個(gè)核細(xì)胞,細(xì)胞貼壁培養(yǎng),加細(xì)胞因子白介素-4(IL-4),粒-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF),培養(yǎng)至第3天和第10天時(shí),以流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞表面CD80、CD83表達(dá)情況,以證實(shí)是否已成為成熟的DC。

3、以激光共聚焦顯微鏡觀察化療后A549細(xì)胞表面鈣網(wǎng)織蛋白暴露情況。
　　 結(jié)果:
　　 1mg/L、3mg/L、5mg/L阿霉素與A549細(xì)胞孵育12h后,A549細(xì)胞凋亡率(％)分別為17.6±1.77,62.93+1.70,16.8+0.65。9mg/L、13mg/L、21mg/L順鉑與A549細(xì)胞孵育12h后,A549細(xì)胞凋亡率(％)分別為52.99±8.39,62.44±3.41,47.14±8.99。表明阿霉素及

4、順鉑均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,3mg/L阿霉素和13mg/L順鉑處理12h后A549細(xì)胞凋亡率較高,且二組相近(P＞0.05),故在后續(xù)試驗(yàn)中分別以3mg/L阿霉素和13mg/L順鉑來(lái)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。
　　 以3mg/L阿霉素處理的早期凋亡A549細(xì)胞為A組,13mg/L順鉑處理的早期凋亡A549細(xì)胞為D組,正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞為N組(對(duì)照組),分別體外刺激培養(yǎng)的DC細(xì)胞并致敏T細(xì)胞,以MTT法檢測(cè)致敏T細(xì)胞對(duì)A549細(xì)

5、胞殺傷力,結(jié)果為:A組OD值為0.6245±0.031715,D組OD值為O.8745±0.032569,N組OD值為0.922627±0.041501,A組與其它兩組比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01),說(shuō)明阿霉素處理的A549細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫原性,能誘發(fā)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)從而殺傷更多腫瘤細(xì)胞。
　　 分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)IL-4、GM-CSF等細(xì)胞因子刺激后,培養(yǎng)至第3天,以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面相關(guān)蛋白,檢測(cè)

6、結(jié)果CDS0為24.67％;CD83為31.13％。培養(yǎng)至第10天,A組抗原刺激的DC的CD80,CD83分別為81.48％、77.40％;D組抗原刺激的DC的CD80,CD83分別為80.82％,91.61％;N組抗原刺激的DC的CDS0,CD83分別為83.89％、94.71％。上述結(jié)果提示,培養(yǎng)10d后DC細(xì)胞表面CDS0,CD83表達(dá)顯著增加。CD80為共刺激分子,可誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖、活化,CD83是樹(shù)突狀細(xì)胞的特異性標(biāo)志,參與

7、抗原遞呈和淋巴細(xì)胞活化。鏡下形態(tài)觀察:細(xì)胞培養(yǎng)初期可見(jiàn)條形、分枝狀細(xì)胞,細(xì)胞貼壁;培養(yǎng)后期,懸浮的細(xì)胞明顯增多,以散在的細(xì)胞為主,細(xì)胞體積增大,細(xì)胞表面可見(jiàn)毛刺狀的突起,呈不規(guī)則的樹(shù)突狀。上述細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測(cè)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變說(shuō)明培養(yǎng)的細(xì)胞為樹(shù)突狀細(xì)胞,且培養(yǎng)至第10天時(shí)已處于成熟狀態(tài)。
　　 以免疫學(xué)技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察A549細(xì)胞表面鈣網(wǎng)織蛋白表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)阿霉素處理的A549細(xì)胞表面可見(jiàn)鈣網(wǎng)織蛋白出現(xiàn),順鉑處理

8、的A549細(xì)胞及非處理的對(duì)照組A549細(xì)胞表面未見(jiàn)鈣網(wǎng)織蛋白出現(xiàn)。表明經(jīng)阿霉素處理的A549細(xì)胞表面有鈣網(wǎng)織蛋白暴露,這可能與阿霉素較順鉑能誘發(fā)更強(qiáng)免疫原性有關(guān)。進(jìn)一步將鈣網(wǎng)織蛋白阻斷劑加入阿霉素處理的A549細(xì)胞中,在與A組相同條件下,檢測(cè)其對(duì)A549細(xì)胞殺傷效應(yīng),結(jié)果顯示該組OD值為:0.770727±0.006191,高于A組(0.6245±0.031715),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),說(shuō)明以鈣網(wǎng)織蛋白阻斷劑來(lái)阻斷細(xì)胞膜

9、上暴露的鈣網(wǎng)織蛋白與DC的結(jié)合,可降低阿霉素誘導(dǎo)的免疫原性,進(jìn)一步證實(shí)阿霉素引起的A549細(xì)胞鈣網(wǎng)織蛋白的暴露是其產(chǎn)生免疫原性的重要原因。
　　 結(jié)論:
　　 1、阿霉素及順鉑均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞早期凋亡,呈非劑量依賴(lài)性。2、阿霉素誘導(dǎo)的早期凋亡A549細(xì)胞較順鉑誘導(dǎo)的早期凋亡A549細(xì)胞有較強(qiáng)的免疫原性。其發(fā)生機(jī)制與阿霉素處理的早期凋亡A549細(xì)胞細(xì)胞膜表面鈣網(wǎng)織蛋白暴露有關(guān)。3、本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的阿霉素可引起A549細(xì)胞鈣