白細(xì)胞去除對內(nèi)毒素血癥犬凝血功能及肺損傷的影響.pdf

1、42-43,46機(jī)體在受到嚴(yán)重創(chuàng)傷的情況下，會引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至發(fā)展成多器官功能不全或多器官衰竭，在這一動態(tài)變化過程中，肺組織常常是最易受損傷的首位靶器官，而發(fā)展成急性肺損傷(acute lung injury，ALI)或急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratory distresss syndrome，ARDS)，其中ARDS是ALI的嚴(yán)重階段。目前只有低潮氣量通氣能降低ALI/ARDS 病人的病死率，尚無有效的藥物

2、治療。迄今仍是臨床重癥醫(yī)學(xué)研究的熱點和難點之一。大量研究表明，中性粒細(xì)胞及釋放的炎癥因子、自由基和損傷性酶類，特別是中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶在ALI/ARDS的發(fā)病過程中起著重要作用。有臨床和實驗研究表明，凝血和纖溶功能的異常也是ALI/ARDS的重要病理生理特征，目前傾向認(rèn)為凝血功能異常是ALI/ARDS的重要因素，凝血功能損傷輕的動物不易發(fā)生ALI/ARDS。白細(xì)胞去除(leukocytapheresis，LCAP)是利用特定裝置以在體

3、內(nèi)或離體狀態(tài)下去除血液中的白細(xì)胞，從而獲得少白細(xì)胞血，進(jìn)而減輕白細(xì)胞所致炎性損傷的技術(shù)。目前國內(nèi)白細(xì)胞去除主要運(yùn)用于高白細(xì)胞急性白血病(high leukocyteacute leukemia，HLAL)的治療，有人發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞去除可使合并的ARDS 得到緩解。目前LCAP 運(yùn)用于內(nèi)毒素血癥引起肺損傷的文獻(xiàn)報道較少。本實驗運(yùn)用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)建立內(nèi)毒素血癥犬模型，通過LCAP 減少外周血中的白細(xì)胞，特

4、別是中性粒細(xì)胞，觀察實驗動物外周血和肺泡灌洗液內(nèi)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、凝血纖溶功能的變化及肺損傷的發(fā)生率?？赏麨長CAP在ALI/ARDS 病人中運(yùn)用提供理論和實驗依據(jù)，也為ALI/ARDS的防治提供新的策略。
　　 目的：
　　 觀察部分白細(xì)胞去除對內(nèi)毒素血癥犬外周血和肺內(nèi)凝血纖溶功能的影響及ALI/ARDS的發(fā)生率的情況，探討活化中性粒細(xì)胞影響內(nèi)毒素血癥犬的凝血纖溶機(jī)制。
　　 方法：
　　 30只雄

5、性雜種犬采用數(shù)字隨機(jī)法分為LPS組(L組)，偽白細(xì)胞去除對照組(S組)，白細(xì)胞去除治療組(T組)三組，每組10只。L組只給予LPS 輸注，不行LCAP；S組在LPS 輸注后12h～14h 行偽白細(xì)胞去除；T組在LPS 輸注后12h～14h 行LCAP。將血細(xì)胞分離機(jī)選擇MNC分離程序進(jìn)行白細(xì)胞分離。經(jīng)中心靜脈輸注LPS(2mg/kg)建立內(nèi)毒素血癥犬模型，LPS 用0.9％的氯化鈉100毫升稀釋后用微量輸液泵輸注，30分鐘內(nèi)滴注完畢。實

6、驗過程中吸氧濃度為29％，并根據(jù)平均動脈壓(mean arteriAlpressure，MAP)、肺動物楔壓(pulmonary arteriAlwedge pressure，PAWP)調(diào)整輸液速度：乳酸林格氏液以7ml/kg?h 補(bǔ)充；當(dāng)MAP<70mmHg時，以10ml/kg?h 補(bǔ)充。但當(dāng)PAWP>18mmHg時，補(bǔ)液回到前一水平。在LPS 輸注0h，LPS 輸注后2h、6h、12h、14h、16h、24h及36h 抽取外周血，立

7、即4℃，3000r/min 離心10min，取上清液保存于-80℃冰柜中，待標(biāo)本收齊后，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophilelastase，NE)、活化蛋白C(activated protein C，APC)、可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白(solublethrombomodulin，sTM)、纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor type-1，PAI-1)水

8、平；36h時切取右肺中葉進(jìn)行肺泡灌洗后檢測灌洗液中NE、sTM、APC、PAI-1的水平；取右肺上葉用免疫組化染色檢測TM的表達(dá)情況；取右肺下葉行濕/干重檢測，普通病理觀察，并拍照。
　　 結(jié)果：
　　 1、白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞結(jié)果：LPS 輸注后，各組實驗動物外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞在2小時降至最低，爾后逐漸升高，白細(xì)胞在12h 升至基礎(chǔ)水平，但中性粒細(xì)胞比例明顯升高。T組經(jīng)部分白細(xì)胞去除后，在14h、16h時間點白細(xì)胞

9、及中性粒細(xì)胞水平顯著低于L組及S組(P<0.05)，在36h時間點三組白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞水平均顯著高于LPS 輸注前水平(P<0.05)，T組WBC及PMN水平明顯低于L組(P<0.05)，L組與S組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 2、外周血氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)結(jié)果：LPS 輸注后，各組實驗動物氧合指數(shù)逐漸降低，T組經(jīng)部分白細(xì)胞去除后，在24h、36h時間點氧合指數(shù)[(319±23; 311±25) mmHg

10、]明顯高于L組[(287±30；274±29) mmHg]水平(P<0.05)，T組氧合指數(shù)顯著高于L組及S組， L組與S組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 3、外周血及肺泡灌洗液中NE 結(jié)果：LPS 輸注后，各組實驗動物NE 逐漸升高，T組經(jīng)部分白細(xì)胞去除后，在14h、16h時間點明顯低于S組及L組(P<0.05)，在36h時間點三組NE水平均顯著高于LPS 輸注前水平(P<0.05)，T組肺泡灌洗液中NE 明顯低于L

11、組及S組(P<0.05)。T組血清NE水平明顯低于L組和S組(P<0.05)，L組與S組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 4、外周血及肺泡灌洗液中sTM 結(jié)果：LPS 輸注后，各組實驗動物外周血中sTM逐漸升高，T組經(jīng)部分白細(xì)胞去除后，在14h、16h時間點[(9.688±0.914)、(10.492±0.865)μg/ml]明顯低于L組[(11.005±0.854)、(12.04±0.954)μg/ml](P<0.05

12、)，在36h時間點各組sTM水平均顯著高于LPS 輸注前水平(P<0.05)，在肺泡灌洗液中T組sTM 明顯低于L組及S組(P<0.05)。T組血清sTM水平明顯低于L組及S組(P<0.05)，L組與S組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 5、外周血及肺泡灌洗液中APC 結(jié)果：LPS 輸注后，各組實驗動物APC 逐漸降低，T組經(jīng)部分白細(xì)胞去除后，在14h、16h時間點[(50.805±4.422)、(40.480±2.99

13、3)μg/ml]明顯高于L組[(45.881±4.024)、(35.935±4.057)μg/ml](P<0.05)，在36h時間點各組APC水平均顯著低于LPS 輸注前水平(P<0.05)，在肺泡灌洗液中T組APC 明顯高于L組及S組(P<0.05)。T組血清APC水平明顯高于L組及S組(P<0.05)，L組與S組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 6、外周血及肺灌洗液中PAI-1結(jié)果：LPS 輸注后，各組實驗動物PAI

14、-1水平逐漸升高，T組經(jīng)部分白細(xì)胞去除后，在14h、16h時間點明顯低于S組及L組(P<0.05)，在36h時間點各組PAI-1水平均顯著高于LPS 輸注前(P<0.05)，在肺泡灌洗液中T組PAI-1明顯低于L組及S組(P<0.05)。T組血清PAI-1水平明顯低于L組及S組(P<0.05)，L組與S組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 7、免疫組織化學(xué)染色觀察內(nèi)毒素輸注后36h 肺組織中TM表達(dá)結(jié)果：TM在T組肺內(nèi)的表

15、達(dá)明顯增加。L組與S組肺組織TM表達(dá)無明顯差異。
　　 8、LPS 輸注后36h 肺組織濕/干重比檢測結(jié)果：與L組及S組相比，T組的肺組織濕/干重水平顯著降低(p<0.05)，L組與S組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 9、LPS 輸注后36h 肺組織普通病理學(xué)觀察結(jié)果：各組肺微血管、肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)均可見較多中性粒細(xì)胞扣押、積聚和滲出，同時可見紅細(xì)胞滲出。各組均可見肺間質(zhì)水腫、微血管擴(kuò)張、充血或出血，但L組及S組

16、損傷相對較重。
　　 10、三組實驗動物ALI/ARDS 發(fā)生率情況：LPS 輸注36h后，L組、S組和T組分別發(fā)生急性肺損傷7/10，8/10和2/10例，T組肺損傷的發(fā)生率明顯低于L組(p<0.05），而L組與S組無顯著差別(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 LPS 誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥犬早期即存在凝血功能增強(qiáng)，纖溶功能抑制，經(jīng)外周血部分白細(xì)胞去除后，明顯減少外周血中的白細(xì)胞、特別是中性粒細(xì)胞，也減少了外周血