Sedlin蛋白對(duì)人軟骨細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制.pdf

1、第一部分靶向增強(qiáng)、干擾人軟骨細(xì)胞SEDL基因，基因芯片檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)變化
　　目的:靶向增強(qiáng)或者干擾人軟骨細(xì)胞SEDL基因，骨再生PCR芯片檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)骨發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究SEDT發(fā)病機(jī)制提供高通量信息。
　　方法:采用定向克隆及大腸桿菌內(nèi)同源重組的方法分別構(gòu)建靶向增強(qiáng)SEDL的腺病毒質(zhì)粒pAd5-SEDL和靶向干擾SEDL的慢病毒質(zhì)粒LV-siSEDL，分別導(dǎo)入293T細(xì)胞包裝成重組腺病毒pAd

2、5-SEDL和重組慢病毒LV-siSEDL，酶切鑒定（課題組前期已完成）。HEK293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒，收集病毒液，檢測(cè)病毒滴度。將重組腺病毒、重組慢病毒以最適感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)分別感染HC-a，實(shí)驗(yàn)分4組:增強(qiáng)組（HC-a/pAd5-SEDL）、增強(qiáng)陰性對(duì)照組(HC-a/ pAd5空載體)、干擾組(HC-a/ LV-siSEDL)、干擾組陰性對(duì)照組(HC-a/LV空載體)，收集4組

3、細(xì)胞mRNA進(jìn)行骨再生PCR芯片檢測(cè)。
　　結(jié)果:1、收獲高滴度重組腺病毒pAd5-SEDL，病毒滴度為2.6×1011 pfu/ml。
　　2、重組腺病毒和重組慢病毒成功感染HC-a，重組腺病毒對(duì)HC-a的MOI值為50，重組慢病毒對(duì)HC-a的MOI值為20。
　　3、基因芯片結(jié)果:SEDL基因表達(dá)改變導(dǎo)致其上下游基因表達(dá)發(fā)生變化，其中與軟骨生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的基因有:COL2A、CD36、FLT1、GDF10、IGF

4、1等。
　　結(jié)論:SEDL基因與骨發(fā)育相關(guān)，軟骨細(xì)胞內(nèi)SEDL基因表達(dá)變化引起細(xì)胞內(nèi)與骨發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)改變，如COL2A等。
　　第二部分 Sedlin蛋白對(duì)人軟骨細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制初步研究
　　目的:結(jié)合基因芯片篩選出來(lái)的差異基因，探索Sedlin蛋白對(duì)人軟骨細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制，進(jìn)一步探索X-連鎖遲發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良的發(fā)病機(jī)制。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為增強(qiáng)組(感染pAd5-SEDL的HC-a)、干

5、擾組(感染LV-SEDLsi的HC-a)、空白對(duì)照組(HC-a)。應(yīng)用MTT法檢測(cè)三組HC-a的增殖活性;QPCR檢測(cè)三組HC-a中SEDL基因和COL2A基因mRNA表達(dá);Western blot檢測(cè)三組HC-a中sedlin蛋白表達(dá);細(xì)胞免疫組化檢測(cè)三組HC-aⅡ型膠原蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:1、與空白對(duì)照組相比，增強(qiáng)組HC-a細(xì)胞增殖活性增高，干擾組細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P＜0.05)。
　　2、QPCR結(jié)果顯示增強(qiáng)組H

6、C-a SEDL基因表達(dá)量最高，空白對(duì)照組其次，干擾組HC-a表達(dá)量明顯降低(P＜0.001)。三組細(xì)胞COL2AmRNA表達(dá)量中，增強(qiáng)組明顯高于空白對(duì)照組和干擾組，干擾組表達(dá)量最低(P＜0.001)。
　　3、三組HC-a中，增強(qiáng)組sedlin蛋白表達(dá)最高，其次為空白對(duì)照組，干擾組表達(dá)量最低(P＜0.001)。
　　4、免疫組化結(jié)果顯示三組HC-a中，增強(qiáng)組Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)量最高，空白對(duì)照組其次，干擾組HC-a內(nèi)幾乎不表