LASER通過HNF-1α-PCSK9調(diào)控膽固醇代謝及zonulin易化腸道細(xì)菌移位致動脈硬化的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 LASER通過HNF-1α-PCSK9途徑調(diào)控肝臟膽固醇代謝
　　背景：
　　高脂血癥是動脈硬化性心血管疾病最重要的危險因素之一。血脂水平與許多因素有關(guān)，其中遺傳變異是研究熱點。全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)許多基因的單核昔酸多態(tài)性與血脂水平相關(guān)，這些變異可以解釋約10-12％的變異幅度。然而約43％的變異位于基因間的非編碼區(qū)域，其功能尚不清楚。最近的研究發(fā)現(xiàn)基因的非編碼區(qū)域可以轉(zhuǎn)

2、錄出眾多的非編碼RNA，而長鏈非編碼RNA更易于分布在疾病相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)區(qū)域。如9p21編碼ANRIL并與PRC2蛋白結(jié)合而調(diào)控下游基因的表達(dá)。因此，我們提出脂蛋白相關(guān)的關(guān)聯(lián)分析區(qū)域同樣可以編碼lncRNA并調(diào)控脂代謝。
　　目的：
　　研究肝臟中是否存在調(diào)控脂代謝的lncRNA。
　　方法：
　　以qRT-PCR的方法測定外周白細(xì)胞中LASER的表達(dá)。以RNA干擾的方法降低HepG2細(xì)胞內(nèi)LASER的表達(dá)后

3、，以酶法或Filipin染色測定細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平，以基因芯片分析干擾LASER后有哪些基因發(fā)生了改變。RNA-蛋白質(zhì)間的相互作用通過RNA免疫共沉淀證實，HNF-1α基因啟動子區(qū)域的組蛋白甲基化通過染色質(zhì)免疫共沉淀檢測。
　　結(jié)果：
　　我們在血脂相關(guān)多態(tài)性熱點區(qū)域鑒定了一個lncRNA(LASER)。臨床研究發(fā)現(xiàn)LASER的表達(dá)與含膽固醇的脂蛋白及PCSK9含量呈正相關(guān)。降低LASER的表達(dá)后可以降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平并影響

4、膽固醇代謝的相關(guān)基因，其中PCSK9及其轉(zhuǎn)錄因子HNF-1α的表達(dá)均下降。同時，在給予HNF-1α的天然的拮抗劑黃連素后可以阻斷LASER對PCSK9的作用。LASER通過在核內(nèi)與CoREST/REST蛋白復(fù)合體的LSD1結(jié)合干擾了LSD1的活性，從而導(dǎo)致HNF-1α基因啟動子抑制性的H3K4me2增加。與此同時，降低LSD1的表達(dá)則可以阻斷LASER對HNF-1α-PCSK9的作用。最后，我們發(fā)現(xiàn)他汀類可以升高LASER的表達(dá)，同時導(dǎo)

5、致PCSK9增加，膽固醇可以反向激活LXR受體調(diào)控LASER的表達(dá)。我們的研究可能部分解釋了“他汀逃逸”的現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
　　我們發(fā)現(xiàn)一個新的調(diào)控肝臟膽固醇代謝的lncRNA-LASER。而抑制LASER可與他汀協(xié)同發(fā)揮聯(lián)合調(diào)脂的效應(yīng)。
　　第二部分 Zonulin易化腸道細(xì)菌移位參與動脈硬化的機(jī)制研究
　　背景：
　　動脈硬化性心血管疾病導(dǎo)致的死亡仍高居不下，其中炎癥激活在動脈硬化的進(jìn)展中發(fā)揮了重要的

6、作用。大量的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)冠心病的發(fā)生與多種病原微生物相關(guān)（肺炎衣原體、幽門螺桿菌及巨細(xì)胞病毒等）。腸道中存在著種類眾多的共生菌。腸道共生菌可以通過磷脂酰膽堿和左卡尼汀的代謝而間接致動脈硬化，但目前仍缺乏腸道微生物直接致動脈硬化的直接證據(jù)。約95％的動脈硬化斑塊中能檢測到細(xì)菌的16SrRNA基因成分，其中以腸桿菌科為主。同時，我們前期發(fā)現(xiàn)冠心病人全血中腸道菌屬的熒光假單胞菌及沙雷氏菌含量增加，提示除了間接作用外，腸道細(xì)菌還可能直接參與

7、了動脈硬化的進(jìn)展。
　　生理狀況下腸道間的緊密連接將腸道細(xì)菌與循環(huán)隔絕開來，在動脈硬化等病理情況下細(xì)菌能否穿過腸道屏障并進(jìn)入動脈硬化斑塊內(nèi)目前尚不清楚。腸道細(xì)胞間的緊密連接在決定腸道通透性及控制腸道細(xì)菌移位方面發(fā)揮了重要的作用，其中zonulin（連蛋白）是腸道細(xì)胞合成的分泌蛋白，在調(diào)節(jié)緊密連接開放和決定腸道細(xì)胞通透性方面發(fā)揮了重要的作用。既往研究表明循環(huán)中zonulin的水平在糖尿病、肥胖等動脈硬化的危險因素中升高。
　　

8、目的：
　　動脈硬化的發(fā)生和發(fā)展中，是否也有zonulin的改變，而zonulin調(diào)控的腸道通透性改變是否參與了腸道細(xì)菌的移位呢？
　　方法：
　　以ELISA的方法測定血漿中的zonulin含量。體外培養(yǎng)Caco2細(xì)胞層構(gòu)建腸上皮屏障模型，培養(yǎng)熒光假單胞菌并以菌液干預(yù)腸上皮屏障模型。于不同時間點取Transwell小室的上層及下層的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，并照相記錄菌落生長情況。以掃描電鏡觀察熒光假單胞菌暴露對腸上皮屏障