碳酸酐酶12在腰椎間盤髓核退變中的作用及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 新型椎間盤髓核標(biāo)志物在退變髓核中的表達(dá)和評(píng)估
　　目的:評(píng)估包括碳酸酐酶12(CA12)在內(nèi)的新髓核標(biāo)志物在腰椎退行性疾病病人髓核組織中的標(biāo)志作用。
　　方法:我們從脊柱手術(shù)病人中收集了81例髓核標(biāo)本，分成退變組和對(duì)照組。每個(gè)標(biāo)本都以腰椎磁共振、HE染色和番紅O染色評(píng)估退變程度，并以qPCR檢測(cè)aggrecan、II型膠原和SOX9的表達(dá)水平。所有標(biāo)本均以qPCR方法檢測(cè)C

2、A12及其他12個(gè)新椎間盤髓核標(biāo)記物的表達(dá)水平。以免疫組織化學(xué)和Western Blot檢測(cè)組織中CA12的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:在退變組中，CA12及其他11個(gè)新髓核標(biāo)記物表達(dá)顯著低于對(duì)照組，且為椎間盤退變的危險(xiǎn)因素，以CA12等單因素分析的B值最小。此外，CA12在蛋白水平上也有顯著差異表達(dá)。
　　結(jié)論:CA12等12個(gè)新髓核標(biāo)記物在退變髓核中有差異表達(dá)，可以作為髓核退變標(biāo)記物。
　　第二部分 CA12在椎間盤退變

3、中的作用及其調(diào)控機(jī)制
　　目的:闡明CA12在椎間盤髓核代謝中的作用及其上游調(diào)控機(jī)制。
　　方法:為探索CA12在髓核細(xì)胞中的具體功能，我們以CA12 siRNA處理大鼠髓核細(xì)胞，并檢測(cè)合成代謝和分解代謝相關(guān)指標(biāo)，同時(shí)，我們?cè)贑A12 siRNA處理并上調(diào)pH時(shí)檢測(cè)合成代謝和分解代謝相關(guān)指標(biāo)。我們以實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了81例人退變或正常髓核標(biāo)本中的缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)和HIF-2α的表達(dá)。我們?cè)诘脱鯒l件下培養(yǎng)大鼠

4、髓核細(xì)胞，并檢測(cè)低氧誘導(dǎo)CA12的表達(dá)。為驗(yàn)證脯氨酸脫氫酶(PHD)/HIF-1對(duì)CA12表達(dá)的調(diào)控，我們以HIF-1α siRNA和PHD抑制劑DMOG處理大鼠髓核細(xì)胞，并檢測(cè)CA12表達(dá)水平。
　　結(jié)果:在低氧環(huán)境下，CA12表達(dá)可以增加約30倍。HIF-1α，而不是HIF-2α的表達(dá)水平也在退變髓核中下降，并與CA12表達(dá)成正相關(guān)。HIF-1α水平敲低能夠?qū)е翪A12水平下降，而DMOG處理后CA12的表達(dá)水平升高。CA12

5、敲低可以顯著抑制合成代謝相關(guān)分子表達(dá)，而分解代謝分子保持不變。而上調(diào)pH后Ⅱ型膠原和SOX9也可以上調(diào)。
　　結(jié)論:CA12的表達(dá)受PHD/HIF-1軸調(diào)控。CA12可能可以通過調(diào)節(jié)pH影響髓核合成代謝，在椎間盤退行性疾病中起重要作用。
　　第三部分 器官培養(yǎng)模型中驗(yàn)證PHD/HIF-1/CA12對(duì)椎間盤退變的作用
　　目的:進(jìn)一步驗(yàn)證PHD/HIF-1對(duì)CA12的調(diào)控作用及對(duì)椎間盤退變的作用。
　　方法:建立全

6、椎間盤培養(yǎng)模型，以DMOG和/或碳酸酐酶抑制劑ACTZ處理全椎間盤培養(yǎng)模型，以HE染色和番紅O染色從組織學(xué)水平驗(yàn)證退變程度，以qPCR檢測(cè)aggrecan、Ⅱ型膠原、Ⅰ型膠原、SOX9、CA12和HIF-1α的mRNA水平的表達(dá)，以Western Blot檢測(cè)CA12和HIF-1α蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:與對(duì)照組比較，DMOG處理組的髓核基質(zhì)明顯增多，aggrecan、Ⅱ型膠原和SOX9的表達(dá)也顯著增多，而DMOG+ACTZ處