I型鴨肝炎病毒中國(guó)流行株生物學(xué)特性相關(guān)研究.pdf

1、鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)是引起鴨病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)的病原,該病毒可分為3個(gè)血清型,即DHV-1、DHV-2和DHV-3,這3個(gè)血清型之間無(wú)血清學(xué)交叉反應(yīng),其中DHV-1分為A、B和C3個(gè)基因型,DHV-1在世界范圍內(nèi)流行和分布,是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要病原,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 本研究以DHV-1流行病學(xué)調(diào)查為切入點(diǎn),收集和采集了2003—2

2、010年中國(guó)主要的養(yǎng)鴨地區(qū),包括山東、廣東、北京、福建、江蘇和云南等省市110多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)鴨的肝臟病料,通過(guò)接種9-11日齡SPF鴨胚,接種后72h內(nèi)收集尿囊液并盲傳3代以上,觀察接種胚體的病理變化,結(jié)合基因鑒定等方法,分離到16株DHV-1病毒。大多數(shù)DHV-1病毒陽(yáng)性病料接種鴨胚后,第一代或第二代鴨胚就會(huì)出現(xiàn)明顯病變,表現(xiàn)為全身出血、發(fā)育受阻、胚死亡等病理變化,且鴨胚尿囊液對(duì)雞外周血紅細(xì)胞沒(méi)有凝集活性,表明尿囊液中不含能夠凝集雞血紅細(xì)

3、胞的禽正粘病毒、副粘病毒等。
　　 為進(jìn)一步了解中國(guó)DHV-1的分子特征、基因遺傳演化特征以及不同基因型病毒的分布,本研究通過(guò)對(duì)GenBank上發(fā)表的其他毒株基因組序列進(jìn)行比對(duì),在保守區(qū)設(shè)計(jì)6對(duì)引物,同時(shí)應(yīng)用3’端擴(kuò)增技術(shù)和RT-PCR的方法獲得了這16株DHV-1病毒的全部基因組序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn),16株病毒的基因組全長(zhǎng)在7702nt到7761nt之間。由于DHV-1病毒為小RNA病毒科中未分類(lèi)病毒,因此本研究首先利用全基因組遺傳

4、發(fā)育分析將分離到的16株病毒與小RNA病毒科其它7個(gè)病毒屬的14株病毒進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)本研究分離到的DHV-1與其他小RNA病毒具有較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系,提示DHV-1應(yīng)該劃分為小RNA科內(nèi)的一個(gè)新屬。在此基礎(chǔ)上,本研究將16株DHV-1病毒與64株DHV-1參考毒株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化比較,表明DHV-1可分為A、B和C3個(gè)基因型,與已報(bào)道結(jié)果一致。本研究分離到的16個(gè)毒株中,13個(gè)屬于基因A型,另外3個(gè)為基因C型。本研究未分離到基因B型DHV

5、-1病毒。在對(duì)DHV-1基因組序列比較分析時(shí)發(fā)現(xiàn),基因C型成員基因組略長(zhǎng)于基因A型病毒基因組,分別在VP1基因和3’UTR內(nèi)有插入。同一基因型內(nèi)的DHV-1病毒序列同源性在90％以上,而不同基因型病毒序列同源性不足80％。
　　 為研究DHV-1對(duì)鴨的致病性,本研究選擇基因A型病毒Du／CH／LBJ／090809作為代表毒株對(duì)雛鴨進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示該毒株對(duì)SPF雛鴨的致死率為30％,攻毒24h后部分雛鴨開(kāi)始死亡,死亡鴨的病變

6、部位主要集中在肝臟,表現(xiàn)為肝臟腫大、出血及壞死等；同時(shí)伴有脾臟和膽囊腫大等病理變化。此外,本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了Du／CH／LBJ／090809病毒的7個(gè)重組蛋白以建立ELISA檢測(cè)方法,通過(guò)比較篩選,發(fā)現(xiàn)重組的VP0和VP1-2蛋白免疫原性較好,而且具有較好的重復(fù)性,可以作為檢測(cè)抗原。以此作為包被抗原,建立ELISA抗體檢測(cè)方法,發(fā)現(xiàn)Du／CH／LBJ／090809感染后的雛鴨第8天開(kāi)始發(fā)生血清陽(yáng)轉(zhuǎn),12天達(dá)到高峰,32天之內(nèi)抗

7、體仍為陽(yáng)性。
　　 為了進(jìn)行DHV-1的雞胚適應(yīng),以便為疫苗研制等奠定基礎(chǔ),本研究通過(guò)9-11日齡雞胚系列傳代,成功將Du／CH／LBJ／090809適應(yīng)雞胚。發(fā)現(xiàn)第29代(P29)病毒能夠穩(wěn)定地在雞胚中繁殖并致雞胚典型病變,利用該雞胚傳代適應(yīng)毒株接種雛鴨,發(fā)現(xiàn)其對(duì)SPF雛鴨不產(chǎn)生致病作用。繼續(xù)傳至第40代(P40)進(jìn)行雛鴨的接種和親本強(qiáng)毒的攻毒試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)該病毒不但不引起雛鴨發(fā)病,而且能對(duì)親本強(qiáng)毒的攻擊提供了良好的保護(hù)性。表明該

8、毒株具有疫苗研制的良好性能。為了進(jìn)一步說(shuō)明雞胚適應(yīng)和致弱過(guò)程在基因組水平的體現(xiàn),本研究對(duì)P16、P29和P40的基因組與其親本毒基因組進(jìn)行比較分析,結(jié)果顯示,病毒在適應(yīng)雞胚過(guò)程中,病毒基因組發(fā)生了明顯變化,主要表現(xiàn)為核苷酸的突變及其導(dǎo)致的氨基酸的替代,突變的主要位點(diǎn)位于L、VP1、2C和3D蛋白。
　　 在以上研究基礎(chǔ)上,本研究以弱毒株Du／CH／LBJ／090809 P40基因組為基礎(chǔ),進(jìn)行基因點(diǎn)突變的分子修飾,構(gòu)建了cDNA