楊樹莖尖小RNA組學(xué)和種子萌發(fā)技術(shù)研究.pdf

1、楊樹易繁殖、生長(zhǎng)迅速，是世界上廣泛栽培的重要用材樹種。楊樹全基因組已被測(cè)序，成為林木科學(xué)研究的模式樹種。林木地上部分的生長(zhǎng)主要來(lái)自于莖尖分生組織(shoot apicalmeristems，SAM)的發(fā)育分化。莖尖分生組織是位于植物頂端具有持續(xù)分化能力的組織，通過(guò)細(xì)胞分裂、分化產(chǎn)生莖、葉和花等器官。植物莖尖分生組織的分化進(jìn)程由復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，目前關(guān)于木本植物的SAM研究主要集中在激素和轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，而有關(guān)SAM轉(zhuǎn)錄后水平研究尚未見報(bào)

2、道。miRNAs是一類重要的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控因子，其參與SAM生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)調(diào)控機(jī)制卻不清楚。本研究中，以毛白楊(Populus tomentosa)不同生長(zhǎng)階段的莖尖分生組織為主要研究對(duì)象，以莖尖分化形成的葉片為對(duì)照，采用高通量測(cè)序方法構(gòu)建莖尖分生組織和葉片的小RNA數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行比較研究分析。此外，除莖尖分生組織外，種子萌發(fā)是林木樹種生長(zhǎng)發(fā)育以及有性繁殖的重要基礎(chǔ)，然而不同外界因素對(duì)楊樹種子萌發(fā)影響的研究報(bào)道卻較少。因此，本論文也研究了

3、不同外界環(huán)境因素對(duì)楊樹種子萌發(fā)的影響。主要結(jié)果如下:
　　(1)在莖尖和葉片中分別獲得11，321，446和11，926，435個(gè)clean reads，文庫(kù)中的小RNA序列長(zhǎng)度主要分布18nt到30nt之間，且主峰值在21nt處，符合被子植物典型miRNAs長(zhǎng)度分布。
　　(2)比對(duì)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得莖尖和葉片中已知miRNAs共計(jì)231和256種。同時(shí)，在楊樹莖尖和葉片中，分別預(yù)測(cè)到185和181個(gè)新miRNA

4、s。
　　(3)根據(jù)楊樹全基因組序列、應(yīng)用生物信息學(xué)網(wǎng)站程序psRobot和TargetFinder進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，已知miRNAs預(yù)測(cè)到1796個(gè)靶基因，新miRNAs預(yù)測(cè)到1507個(gè)靶基因。這些靶基因的功能均主要集中在蛋白結(jié)合、細(xì)胞進(jìn)程和催化活性等通路上。
　　(4)對(duì)于差異表達(dá)miRNAs的分析，與葉片比較，已知miRNAs中莖尖上調(diào)的有14個(gè)，下調(diào)的有54個(gè);新miRNAs中莖尖上調(diào)的有27個(gè)，下調(diào)的有30

5、個(gè)。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)miRNAs的靶基因進(jìn)行功能注釋，結(jié)果表明已知miRNAs中莖尖表達(dá)量上調(diào)miRNAs的靶基因功能主要集中在光敏色素互作、葉片著色和葉形態(tài)建成等途徑;莖尖表達(dá)量下調(diào)miRNAs的靶基因功能主要集中在細(xì)胞分裂分化、生長(zhǎng)素響應(yīng)和細(xì)胞分裂素響應(yīng)等與激素響應(yīng)有關(guān)的途徑。同時(shí)，新miRNAs中莖尖表達(dá)量上調(diào)miRNAs的靶基因功能主要集中在捕光葉綠素合成和葉綠素酸酯a加氧酶等與光合作用相關(guān)的的途徑;莖尖表達(dá)量下調(diào)miRNAs的

6、靶基因功能主要集中在RNA聚合酶等途徑。這些結(jié)果表明，莖尖在發(fā)育過(guò)程中，可通過(guò)激素相關(guān)miRNAs負(fù)向調(diào)控其靶基因，進(jìn)而影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育。
　　(5)ptc-miR166家族成員中ptc-miR166n、ptc-miR166o和ptc-miR166q在莖尖分生組織中均顯著下調(diào)，并靶向多個(gè)與細(xì)胞分裂分化相關(guān)的Ⅲ型HD-ZIP(classⅢHOMEODOMAIN-LEUCINE ZIPPER)轉(zhuǎn)錄因子家族成員。進(jìn)一步進(jìn)行qRT-PC

7、R實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ptc-miR166及其靶基因HD-ZIP在分化過(guò)程中，表達(dá)量呈現(xiàn)出相反趨勢(shì)，表明HD-ZIP可能是ptc-miR166的目標(biāo)靶基因，ptc-miR166通過(guò)負(fù)反饋調(diào)控HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子在莖尖分生組織中起到重要調(diào)控作用。
　　(6)ptc-miR393家族成員中ptc-miR393a、ptc-miR393b和ptc-miR393c在莖尖中均顯著下調(diào)，并靶向多個(gè)與生長(zhǎng)素響應(yīng)相關(guān)的TRI1(transport inhib

8、itor responseⅠ)轉(zhuǎn)錄因子。熒光定量結(jié)果表明，ptc-miR393及其靶基因TRI1在發(fā)育過(guò)程中，表達(dá)量呈現(xiàn)出相反趨勢(shì)，說(shuō)明TRI1可能是ptc-miR393的目標(biāo)靶基因，ptc-miR393通過(guò)負(fù)反饋調(diào)控TRI1轉(zhuǎn)錄因子在生長(zhǎng)素響應(yīng)過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。
　　(7)以毛白楊種子為實(shí)驗(yàn)材料，研究不同溫度、鹽分、pH值和光照強(qiáng)度對(duì)毛白楊種子萌發(fā)的影響。毛白楊種子在晝夜溫度為23℃/18℃時(shí)，種子發(fā)芽率最高。同時(shí)，種子發(fā)芽能

9、力明顯受鹽脅迫影響，發(fā)芽率隨鹽濃度的增加而下降。此外，酸堿度也可影響種子萌發(fā)，種子在中性環(huán)境下萌發(fā)率最高。在一定光照強(qiáng)度下，種子的發(fā)芽率會(huì)隨著光照強(qiáng)度的增加而增加，表明光照促進(jìn)種子的萌發(fā)。
　　本研究以毛白楊莖尖分生組織和葉片為材料，建立了兩個(gè)小RNA文庫(kù)，篩選出差異表達(dá)的miRNAs，并且結(jié)合預(yù)測(cè)獲得的靶基因及靶基因功能注釋，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)，研究了miRNAs與預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)關(guān)系及其在毛白楊莖尖分化與發(fā)育過(guò)程中的功能。