水禽細小病毒VP3蛋白表位鑒定及重組腺病毒載體構(gòu)建.pdf

1、鵝細小病毒(Goose parvovirus，GPV)和番鴨細小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)是動物病毒中最小的一類單鏈DNA病毒，屬細小病毒科細小病毒屬，臨床上以腹瀉、滲出性腸炎等為主要臨床癥狀，表現(xiàn)較高的發(fā)病率和死亡率，嚴重危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。通過對水禽細小病毒VP3蛋白抗原表位的鑒定及其重組腺病毒載體的構(gòu)建，為GPV和MDPV新疫苗的研發(fā)和治療提供新的參考。
　　 抗原表位對免疫治療試劑

2、和疫苗的設(shè)計等有重要意義。本研究利用噬菌體展示技術(shù)對純化后的GPV VP3蛋白單克隆抗體4A2進行3輪淘選，在第3輪的淘選中隨機挑選8個克隆進行DNA測序，通過對序列的分析，發(fā)現(xiàn)獲得一致序列DYRFHH。與VP3蛋白氨基酸序列對比后，發(fā)現(xiàn)該序列與第65～88位的氨基酸有很高的同源性，確定該表位為65DYRFHH88。為進一步驗證該序列是否為一抗原表位，以噬菌體為包被抗原，做ELISA檢測，結(jié)果表示DYRFHH可以被單抗4A2特異性識別，

3、證實65DYRFHH88為一構(gòu)象表位。VP3蛋白抗原表位的精確鑒定，可以幫助了解其抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，并為GPV和MDPV亞單位疫苗的設(shè)計和檢測方法的建立提供依據(jù)。
　　 VP3蛋白是水禽細小病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，內(nèi)含GPV主要抗原決定簇成分，是主要免疫保護性抗原，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生具有中和作用的抗體。根據(jù)GPV和MDPV VP3蛋白的基因序列分別設(shè)計合成兩對引物，擴增VP3基因，并利用腺病毒重組技術(shù)將水禽細小病毒VP3基因克隆到pSh

4、uttle-CMV轉(zhuǎn)移載體上，將重組轉(zhuǎn)移載體經(jīng)Pme I酶切線性化后電轉(zhuǎn)入BJ5183感受態(tài)菌種與腺病毒骨架載體pAdEasy-1進行菌內(nèi)同源重組。重組的質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切，分別得到30kb大片段和3kb及4.5kb小片段的重組質(zhì)粒即為陽性質(zhì)粒。將鑒定為陽性的重組腺病毒質(zhì)粒用PacⅠ酶切線性化后轉(zhuǎn)染到HEK-293細胞中，待10d左右細胞出現(xiàn)病變后，收毒傳代，進行PCR和間接免疫熒光鑒定，鑒定結(jié)果表明，實驗成功構(gòu)建了表達VP3基因的重組