多環(huán)芳烴對(duì)土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)影響的研究.pdf

1、多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）是一類(lèi)含有兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)結(jié)構(gòu)的典型有機(jī)污染物，多來(lái)源于石油生產(chǎn)、化石燃料的燃燒、煤炭加工等。因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、疏水性強(qiáng)、難降解、土壤附著能力強(qiáng)，且具有較強(qiáng)的致癌性，致畸性和致突變性的“三致”效應(yīng)，對(duì)人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。
　　土壤對(duì)有機(jī)物具有較大的吸收和降解能力，是PAHs最為重要的匯。與其他環(huán)境一樣，土壤PAHs的降解也主要通過(guò)微

2、生物的代謝作用來(lái)完成。土壤微生物不僅是PAHs自然消除和轉(zhuǎn)化的重要參與者，同時(shí)它們也是有機(jī)或無(wú)機(jī)物污染壓力下土壤質(zhì)量評(píng)估的重要參考指標(biāo)。但微生物多樣性及其群落結(jié)構(gòu)對(duì)PAHs污染的響應(yīng)機(jī)制迄今還不十分明確。因此，本研究首先選擇具有50多年油氣開(kāi)發(fā)歷史的江漢油田附近的農(nóng)田土壤樣品為研究對(duì)象，探索微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤PAHs含量之間的關(guān)系以及油田土壤中苯系物厭氧降解微生物的多樣性；隨后，選擇典型PAHs-蒽，通過(guò)添加蒽的厭氧土壤微宇宙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

3、，探究厭氧條件下蒽的添加對(duì)反硝化微生物活性及豐度的影響；最后，選擇上述培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的部分典型土壤處理，通過(guò)Illumina Miseq測(cè)序?qū)ζ浼?xì)菌的多樣性及群落組成進(jìn)行解析。旨在研究土壤微生物對(duì)PAHs脅迫的響應(yīng)，并為PAHs污染土壤的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和微生物修復(fù)提供一些有用的微生物信息，還可以為進(jìn)一步深入研究PAHs厭氧代謝的微生物機(jī)理打下基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1、油田區(qū)農(nóng)田土壤容易受到PAHs污染，從江漢油田的7個(gè)油井口附近的農(nóng)

4、田中采集了7個(gè)土壤樣品（編號(hào)：OS-1至OS-7）。測(cè)定各樣品的基本性質(zhì)及PAHs含量，并通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序解析了各土壤樣品中細(xì)菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而探討土壤PAHs含量與細(xì)菌及古菌群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，土壤PAHs含量在0.18~0.88 mg·kg-1之間，PAHs污染程度較低。土壤樣品中細(xì)菌和古菌的Chao1指數(shù)與土壤PAHs含量呈顯著負(fù)相關(guān)，但只有細(xì)菌Shannon指數(shù)與土壤PAHs含量呈負(fù)相關(guān)。此外

5、，Mantel相關(guān)分析的結(jié)果也表明，細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與土壤PAHs含量顯著相關(guān)（r2=0.9001, p=0.013），而古菌的群落結(jié)構(gòu)與土壤PAHs含量沒(méi)有顯著相關(guān)性（r2=0.4553, p=0.262）。與低PAHs含量的土壤樣品相比，PAHs含量較高的土壤樣品（OS-3和OS-5）中，放線(xiàn)菌門(mén)中的分枝桿菌屬和微單孢菌屬，變形菌門(mén)中的假單胞菌屬、溶桿菌屬、草酸桿菌屬等，以及古菌中的廣古菌門(mén)具有較高的相對(duì)豐度。這些結(jié)果表明，土壤PAH

6、s污染對(duì)土壤細(xì)菌和古菌群落具有明顯的影響和選擇性。此外，與古菌相比，細(xì)菌對(duì)土壤PAHs污染更為敏感，并且細(xì)菌的多樣性指數(shù)和群落結(jié)構(gòu)均可能是評(píng)估土壤生態(tài)系統(tǒng)受 PAHs脅迫程度的重要參考指標(biāo)。
　　2、油田區(qū)土壤易受烴類(lèi)物質(zhì)影響并可能富集了特異的石油烴厭氧降解微生物。因此，在上一章對(duì)該油田區(qū)土壤中細(xì)菌及古菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面解析的基礎(chǔ)上，本章以石油烴中苯系物厭氧代謝的關(guān)鍵功能基因-bssA（苯甲基琥珀酸合成酶基因）作為分子標(biāo)識(shí)物，通過(guò)

7、克隆文庫(kù)結(jié)合末端限制性片段長(zhǎng)度多樣性（Terminal-Restriction Fragment length polymorphism, T-RFLP）的方法，研究該油田區(qū)土壤含bssA基因的烴類(lèi)厭氧降解微生物群落結(jié)構(gòu)，并探討其環(huán)境驅(qū)動(dòng)機(jī)制。從上述7個(gè)土壤樣品的5個(gè)中（OS-3至OS-7）成功擴(kuò)增到bssA基因，T-RFLP的分析表明不同土壤樣品中的bssA基因多樣性差異明顯，PAHs含量最高土壤中bssA基因多樣性最高，其優(yōu)勢(shì)bss

8、A基因類(lèi)群與硫酸鹽還原菌或地桿菌有較近的親緣關(guān)系。冗余分析（Redundancy analysis, RDA）進(jìn)一步表明，土壤硝態(tài)氮、有效磷、PAHs含量均是影響 bssA基因多樣性的重要因子。上述結(jié)果表明：江漢油田區(qū)典型農(nóng)田土壤中含有bssA基因的主要細(xì)菌類(lèi)群為β-變形菌和δ-變形菌，并與地桿菌屬（Geobacter）、索氏菌屬（Thauera）和固氮菌屬（Azoarcus）具有較近的親緣關(guān)系。這些微生物可能通過(guò)與硝酸鹽、硫酸鹽及鐵還

9、原過(guò)程相偶聯(lián)，厭氧代謝土壤中的油氣類(lèi)有機(jī)污染物。
　　3、研究?jī)?nèi)容2的結(jié)果表明，油田土壤中的bssA菌群可能通過(guò)與硝酸鹽還原等厭氧過(guò)程相偶聯(lián)來(lái)代謝土壤PAHs。因此，本章以反硝化相關(guān)的narG（硝酸鹽還原酶）、nirK（Cu-亞硝酸還原酶基因）和 nirS（細(xì)胞色素 cd1-亞硝酸還原酶基因）以及 bssA基因?yàn)榉肿訕?biāo)識(shí)，通過(guò)定量 PCR的方法，進(jìn)一步探究添加典型 PAHs-蒽和硝酸根的土壤厭氧微宇宙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中土壤反硝化微生物活性

10、及豐度對(duì) PAHs污染的響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)硝酸根濃度（0、30 mg·kg-1）和3個(gè)蒽濃度（0、15、30 mg·kg-1），共6個(gè)處理（編號(hào)：N0A0、N30A0、N0A15、N30A15、N0A30、N30A30），厭氧條件下，25℃恒溫避光培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的第3、7、15和45天取樣測(cè)定N2O和 CO2的產(chǎn)生速率（分別表征土壤微生物的反硝化酶活和呼吸速率）以及各基因豐度。結(jié)果如下：各處理中土壤微生物的反硝化酶活（Denitrifi

11、cation enzyme activity, DEA）在第3d時(shí)最高，N2O的產(chǎn)生速率為135.63~445.34 ug·kg-1干土·h-1，蒽的添加能夠顯著提高土壤微生物的 DEA，且在添加蒽的處理中，NO3-的添加能夠顯著提高土壤微生物的DEA，而在之后的各取樣天，各處理中幾乎檢測(cè)不到N2O的產(chǎn)生。培養(yǎng)初期（3、7和15d），各處理土壤中微生物的呼吸速率無(wú)顯著性差異，而第45d時(shí)，添加蒽的各處理土壤中CO2產(chǎn)生速率顯著高于未添加

12、蒽的處理。功能基因的定量結(jié)果表明蒽的添加能夠顯著提高土壤中narG和nirS基因的豐度，對(duì)nirK沒(méi)有明顯的影響，但是能夠降低土壤中bssA的基因豐度。本實(shí)驗(yàn)中，蒽的添加是影響土壤反硝化微生物活性及豐度的主要因素，而硝酸鹽的添加對(duì)其影響不明顯。
　　4、為了進(jìn)一步探究厭氧條件下土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)對(duì)蒽的響應(yīng)，以研究3中厭氧培養(yǎng)45d的處理N0A0、N0A15、N0A30和N30A30中的土壤樣品為研究對(duì)象，通過(guò)Illumina

13、 MiSeq測(cè)序解析這些土壤樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。細(xì)菌多樣性指數(shù)結(jié)果表明，添加蒽的處理N0A15、N0A30和N30A30土壤樣品中細(xì)菌的Chao1指數(shù)和 Shannon指數(shù)均小于處理 N0A0。各土壤樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）等。相較于處理N0A0，添加蒽的土壤樣品中變形菌門(mén)（Proteob

14、acteria）的相對(duì)豐度增加，而放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）的相對(duì)豐度均有不同程度的降低?；趯偎降姆治霭l(fā)現(xiàn)，處理 N0A0中 Methylophilaceae的相對(duì)豐度僅為0.06％，而添加蒽的各處理中Methylophilaceae相對(duì)豐度達(dá)40%以上，這個(gè)結(jié)果表明蒽的添加使Methylophila