山羊乳腺特異性載體的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染.pdf

1、基因打靶通過DNA轉(zhuǎn)移手段將外源DNA導(dǎo)入靶細胞或組織中，利用外源DNA序列與靶細胞內(nèi)基因組中部分DNA序列間的同源性使它們在分裂前期發(fā)生DNA間的同源重組，從而對靶細胞基因組上的某一確定位點或座位進行精確的遺傳修飾的一門新技術(shù)。乳腺生物反應(yīng)器是基于胚胎操作和轉(zhuǎn)基因技術(shù)平臺，外源基因?qū)雱游锘蚪M中并利用內(nèi)源基因的啟動元件使外源基因在動物乳腺中表達，并利用動物乳腺的分泌能力從乳汁中獲得具有重要使用價值的藥用蛋白等外源蛋白的一類轉(zhuǎn)基因動物

2、的總稱。隨機整合將外源基因隨機導(dǎo)入靶細胞基因組中，由于“位置效應(yīng)”而導(dǎo)致外源基因表達低下甚至沉默。為提高外源蛋白在轉(zhuǎn)基因動物中的表達量，本研究以基因打靶等技術(shù)構(gòu)建山羊乳腺特異性載體，并通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和細胞篩選來獲得中靶轉(zhuǎn)基因山羊胎兒成纖維細胞，以中靶體細胞為核供體細胞生產(chǎn)乳腺生物反應(yīng)器動物，解決了外源基因由于隨機整合而產(chǎn)生“位置效應(yīng)”這一難題，并利用乳蛋白基因的啟動元件在乳腺中高效表達外源基因。 本試驗以山羊β-酪蛋白基因座為打靶

3、位點，從西農(nóng)薩能奶山羊血液中提取DNA基因組，利用LA-PCR分兩段擴增了山羊的β-酪蛋白基因，經(jīng)TA克隆和鑒定后再用LA-PCR的方法從中克隆了該基因的5’端包括調(diào)控序列和信號肽在內(nèi)的3 kb的DNA序列和3'端2 kb的DNA序列作為兩條同源臂。同時以在兩個LoxP之間插有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)并在兩個LoxP外側(cè)各有一個皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的通用性打靶載體pA2T為骨架載體，構(gòu)建了乳腺特異性條件性基因打靶載

4、體。 采用具有廣譜抗菌、抗病毒、改善免疫、組織修復(fù)、改善組織局部血液循環(huán)和分解膿液等作用的人溶菌酶基因和具有溶解血塊、保持血管的暢通等作用且半衰期相對較長的指形區(qū)缺乏的人組織纖溶酶原激活劑基因為打靶載體的外源目的基因，兩者均通過PCR從帶有該基因的載體中克隆出來的，并通過酶切和連接的方法構(gòu)建打靶載體。另外，試驗以帶有核定位信號的AcGFP基因為標記基因，外源目的基因通過具有獨立起始翻譯隨后基因作用的IRES序列與AcGFP基因相

5、聯(lián)系。 以質(zhì)粒pEGFP-C1為骨架載體，先通過改造GFP基因ATG附近的序列使GFP高效表達，再將具有增強剪接作用的間插序列(IVS)與IRES序列與GFP基因相連，再在IVS前加入另一個帶有多克隆位點的IVS，構(gòu)建了載體p3I-GFP，通過細胞轉(zhuǎn)染確實發(fā)現(xiàn)載體p3I-GFP及去除了MluI位點的p3I-GFPN能夠高效表達標記基因，且熒光亮度要明顯高于購買的pIRES2-AcGFP-Nuc載體。再以p3I-GFPN為骨架載體

6、，將人溶菌酶基因?qū)攵嗫寺∥稽c，通過細胞轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)的確能夠表達綠色熒光蛋白。在此基礎(chǔ)上，在CMV啟動子和人溶菌酶基因之間插入山羊CSN2的啟動子，再將GFP基因用從人胎盤中以PCR的方法擴增獲得的干擾素A基因替代，最終構(gòu)建了一個乳腺中獨立表達人溶菌酶和人干擾素蛋白的載體，用于乳腺炎防治的研究。為獲得中靶山羊胎兒成纖維細胞株，本試驗以山羊胎兒成纖維細胞為打靶體細胞，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染細胞后用含800 μg/ml的遺傳霉素初步篩選培養(yǎng)，7天后