克隆綿羊印記相關基因的DNA甲基化研究.pdf

1、體細胞核移植技術在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)等諸多領域有重要的應用價值。盡管利用該技術已經(jīng)成功獲得了多種克隆動物，但隨之而來的克隆胚胎及個體成活率低、不同種屬普遍存在的LOS(large offspring syndrome)等異常制約了體細胞核移植技術的廣泛應用。目前，有許多學者認為不完全表觀重編程是克隆效率低下的原因。本研究通過檢測新生死亡克隆綿羊印記相關基因的：DNA甲基化水平，探究克隆綿羊：DNA甲基化的重編程程度。
　　 本研

2、究主要采用重亞硫酸鹽修飾測序法(BSP)和甲基化特異性PCR(MSP)法檢測了2—3日齡死亡克隆蒙古綿羊腎臟、肺臟、肝臟、心臟和肌肉組織中8個印記相關基因的DNA甲基化水平與正常對照的異同，其中克隆個體羔羊2只，正常對照2只。此外，本研究進一步比較分析了Igf2r、DIK1、Xist和Peg10在克隆綿羊D2和正常對照五種組織中的mRNA表達情況。在進行上述分析之前，本研究首先克隆了部分基因片段。通過實驗得到如下結果：
　　 (

3、1)本研究成功克隆到了綿羊Peg10 1163bp的擬DMR序列(GI：269838596)，848bp綿羊Peg10部分eDNA序列(GI：285014443)，764bp的綿羊xi8t第一外顯于5’端序列及483bp的cDNA序列(GI：285014445)，307bp的綿羊Peg3第一外顯子5’端序列。
　　 (2)綿羊Peg105’端CpG島內(nèi)205bp范圍內(nèi)區(qū)域為差異甲基化區(qū)域。
　　 (3)綿羊Peg3外顯子

4、5’端CpG島內(nèi)232bp范圍內(nèi)11個CpG二核苷酸對上的胞嘧啶在2—3日齡綿羊腎臟和肺臟中基本完全甲基化。
　　 (4)綿羊Cdkn1c外顯子5’端CpG島內(nèi)188bp范圍內(nèi)19個CpG二核苷酸對上的胞嘧啶在2—3日齡綿羊腎臟和肺臟中基本非甲基化。
　　 (5)綿羊腳“轉錄起始位點上游CpG島內(nèi)188bp范圍內(nèi)17個CpG二核苷酸對上的胞嘧啶甲基化模式為馬賽克式，該區(qū)域并非差異甲基化區(qū)域。
　　 (6)綿羊H1

5、9啟動子區(qū)cpG島內(nèi)cTcF結合位點III附近121bp范圍內(nèi)6個CpG二核苷酸對上的胞嘧啶甲基化模式為馬賽克式，該區(qū)域并非差異甲基化區(qū)域。
　　 (7)克隆綿羊D1、D2各組織各印記相關基因的DNA甲基化模式與正常對照基本相同，無明顯差異，僅D2個別組織Dlk1甲基化水平略高于正常對照，D2H19肝組織的甲基化水平高于對照。
　　 (8)克隆綿羊Xist。MsP甲基化結果顯示綿羊Xist分析區(qū)域可能為差異甲基化區(qū)域，而

6、且克隆綿羊的甲基化模式與正常對照無顯著差異。
　　 (9)半定量RT-PCR結果顯示綿羊Xist和Igf2r基因表達基本無組織差異性，而Peg10的mRNA表達表現(xiàn)組織特異性，腎臟中表達水平強于其他組織。
　　 (10)Peg10和D1K1在新生個體組織中的mRNA表達水平比其他檢測基因弱。
　　 (11)克隆綿羊D2腎臟、肺臟、肝臟、心臟和肌肉組織中Xist、Peg10、D1k1和Igf2r基因IRNA的表達水