自噬在膿毒性休克大鼠心功能障礙中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：膿毒癥(Sepsis)是由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒性休克(Septic shock)，是指由膿毒癥誘導(dǎo)的組織低灌注和心血管功能障礙。膿毒癥時常誘發(fā)不同程度的心功能障礙，而心功能障礙的發(fā)生又反過來促進(jìn)了膿毒癥的進(jìn)展和惡化，常常是導(dǎo)致死亡的重要原因。目前對膿毒癥時心功能障礙提出了許多可能機(jī)制，主要包括以下幾點(diǎn)：心肌細(xì)胞缺氧造成氧化磷酸化脫耦聯(lián)，使心肌細(xì)胞產(chǎn)生高能磷酸鹽的能力下降；內(nèi)毒素對心肌的直

2、接毒性作用；通過降低心肌細(xì)胞的收縮力和減少氧耗來維持基本ATP水平的心肌冬眠；一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的變化導(dǎo)致的心肌收縮舒張功能障礙；TNF-α等炎癥介質(zhì)導(dǎo)致的心肌毒性作用；鈣離子通道變化對心肌收縮舒張功能的影響；心肌細(xì)胞凋亡及自噬；其他，如:性別、遺傳、年齡等因素。近年來，心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生引起廣泛關(guān)注，自噬是以細(xì)胞質(zhì)空泡化為特征的溶酶體依賴性降解途徑。它是體內(nèi)長壽蛋白的降解途徑，也是唯一的一個降解退化細(xì)胞器的方式。

3、尤其在心血管疾病發(fā)生時自噬究竟如何變化、起到何種作用更是引起重視。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞特有的，一種相對保守的亞細(xì)胞代謝途徑，其可作為細(xì)胞保持穩(wěn)定狀態(tài)的管家機(jī)制，調(diào)控過氧化物酶體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的不斷更新，還能清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器和代謝產(chǎn)物，進(jìn)行亞細(xì)胞水平的重構(gòu)，保護(hù)受損細(xì)胞提供能量。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬的過度激活則會導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，即Ⅱ型程序性細(xì)胞凋亡，從而引起一系列疾病或加速疾病的進(jìn)程。程序性細(xì)胞死亡具有可調(diào)控性，減少程序性

4、細(xì)胞死亡的發(fā)生有可能做到，因此目前研究程序性細(xì)胞死亡及其與疾病的關(guān)系變得尤為重要。自噬在維持心肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，無論結(jié)構(gòu)還是功能方面都有重要作用。正常心肌存在低水平的自噬，基礎(chǔ)狀態(tài)下心臟的自噬對心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，并對心血管功能有促進(jìn)作用。同時也有觀點(diǎn)認(rèn)為，自噬在心臟疾病中發(fā)揮損傷作用，過度自噬可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，而在已經(jīng)死亡的心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)存在大量自噬體。自噬究竟是導(dǎo)致心肌受損的原因之一還是當(dāng)心臟損傷或應(yīng)激后發(fā)生的代償性修復(fù)反應(yīng)，目前尚

5、未形成統(tǒng)一的意見，但不可否認(rèn)的是，自噬是心臟疾病的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此，想要探究心肌細(xì)胞自噬活性變化的機(jī)制，就需要我們掌握更多自噬活性變化的時程信息以及了解心臟在不同應(yīng)激條件下的自噬效應(yīng)和變化程度。已經(jīng)有大量研究表明，膿毒癥時心肌細(xì)胞凋亡可能參與了心肌功能障礙的發(fā)生，基于上述的研究現(xiàn)狀，我們提出假設(shè):膿毒癥休克不同階段的心功能障礙是否也有自噬的參與？自噬在膿毒癥心肌功能障礙中到底扮演了何種角色，是通過不斷產(chǎn)生新的能量物質(zhì)保護(hù)心肌細(xì)胞免

6、受損害還是通過對自身的降解使心肌細(xì)胞損害加重呢？本研究分別以LPS致膿毒性休克大鼠及LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞株為對象，觀察心肌細(xì)胞自噬水平及心肌收縮舒張功能的變化情況，并在細(xì)胞水平通過分別給與自噬的激動劑及抑制劑來觀察其對心肌收縮舒張功能的影響，我們還通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)來初步探討自噬對心肌收縮舒張功能變化的可能作用機(jī)制。
　　方法：⑴采用LPS靜脈給藥的方法建立大鼠膿毒癥模型。SPF級Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)法分為給藥后2h

7、、4h、6h，每個時間點(diǎn)對應(yīng)相應(yīng)的對照組，共6組，每組8只，實(shí)驗(yàn)前正常進(jìn)食及飲水。20％烏拉坦溶液5ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，剪開左側(cè)腹股溝皮膚，逐層鈍性分離左側(cè)股動脈并置管，通過三通頭與Biopac多導(dǎo)電生理記錄儀壓力換能器連接監(jiān)測平均動脈壓(MAP);同法右側(cè)暴露股靜脈，用于經(jīng)股靜脈給藥，待大鼠左心室插管成功穩(wěn)定15min后泵入LPS20mg/kg(溶于0.2ml液體)，泵速為0.1ml/min，當(dāng)MAP較基礎(chǔ)值降低25-30％時

8、視為膿毒性休克模型。股動/靜脈置管后，取頸前正中縱行切口，鈍性分離右側(cè)頸總動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，動脈夾夾閉近心端。在接扎線處下方插入PE50導(dǎo)管，導(dǎo)管的另一端通過三通頭與Biopac多導(dǎo)電生理記錄儀壓力換能器連接，穩(wěn)定數(shù)分鐘后即可同時監(jiān)測左室舒張末壓(LVEDP)、收縮期左室內(nèi)壓上升最大速率（+dp/dt max）、舒張期左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dt max)等指標(biāo)。⑵每組大鼠到達(dá)相應(yīng)時間點(diǎn)麻醉后迅速剪開胸腔，剪取心臟后立即置于4℃的

9、生理鹽水中，以便于心臟內(nèi)的殘余血泵出，留取左心室肌，將心尖部以10倍體積的4％多聚甲醛溶液固定，取約1mm3大小的心肌組織于2.5％戊二醛中固定，其余心肌組織剪切后分別于-80℃冰箱保存，用于Real-time PCR及WesternBlot等檢測。⑶從液氮中取出凍存管，直接浸入37℃水浴中，在超凈臺中打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。800rpm離心5min后棄去上清液，加入5ml含10％胎牛血清培

10、養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶，于5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。細(xì)胞長滿瓶底80％后，棄去培養(yǎng)基，加入1ml0.25％胰蛋白酶洗一遍，吸去胰酶，再加入1ml0.25％胰酶消化細(xì)胞，潤遍瓶底，倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化并用吸管吹打成細(xì)胞懸液，800rmp離心5min后棄去上清液，再加入適量培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將其平均接種于2-3個培養(yǎng)瓶中，于5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，2-

11、3天更換培養(yǎng)液。⑷實(shí)驗(yàn)前一天，以每毫升3-5×104個H9c2細(xì)胞接種，以保證進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞的融合度20-30％。每孔加入稀釋好的病毒及感染增強(qiáng)液，加入后輕搖細(xì)胞板混合均勻?；靹蚝罄^續(xù)培養(yǎng)，12小時以后觀察細(xì)胞狀態(tài)，更換新鮮完全培養(yǎng)基。感染3天后，觀察熒光表達(dá)情況。給藥干預(yù)組換成加藥培養(yǎng)基，對照組則更換新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。⑸活體大鼠左心室插管術(shù)及心功能測定;HE染色觀察心肌組織病理結(jié)構(gòu);透射電鏡觀察心肌組織自噬小體;免

12、疫組化檢測LC3的表達(dá);免疫熒光雙染技術(shù)觀察心肌細(xì)胞LC3和SERCA2的分布及共定位;MTT實(shí)驗(yàn)對心肌細(xì)胞活性檢測;Real-timePCR檢測心肌組織及心肌細(xì)胞LC3Ⅱ、Beclin1、SERCA2、PLN、及β3-AR mRNA表達(dá);Western Blot檢測心肌組織及心肌細(xì)胞LC3、Beclin1、SERCA2、PLN、及β3-AR蛋白表達(dá)。⑹利用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)比較采用

13、單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。
　　結(jié)果：①膿毒性休克大鼠模型的建立及左心功能的變化。大鼠給予靜脈泵入LPS后血壓出現(xiàn)短暫的下降，之后略有上升，2h后血壓可較基礎(chǔ)值下降25-30％，動態(tài)監(jiān)測MAP變化，模型組的變化與對照組相比各個時間點(diǎn)均有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)，進(jìn)一步分析相同組別內(nèi)不同時間點(diǎn)MAP差異發(fā)現(xiàn)模型組2h、4h、6h MAP值與其0h的基礎(chǔ)值相比明顯下降，均有統(tǒng)計學(xué)

14、意義（*P＜0.05），說明此方法制作的膿毒性休克模型給藥后2h成模，且模型穩(wěn)定。對心肌組織進(jìn)行HE染色后發(fā)現(xiàn)給藥4小時與對照組相比心肌結(jié)構(gòu)紊亂，偶可見炎癥細(xì)胞浸潤。給藥6小時可見明顯肌間組織斷裂，大量炎性細(xì)胞浸潤，提示心肌損傷嚴(yán)重。動態(tài)監(jiān)測膿毒性休克大鼠發(fā)現(xiàn)休克后大鼠的心功能障礙明顯，代表左心室心肌順應(yīng)性的左室舒張末壓(LVEDP)則呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，且實(shí)驗(yàn)組與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(*P＜0.05)。收縮期左室內(nèi)壓上升的最大速率(

15、+dp/dt max)及舒張期左室內(nèi)壓下降的最大速率(-dp/dt max)明顯下降，同時發(fā)現(xiàn)相同組內(nèi)不同時間點(diǎn)與基礎(chǔ)值相比下降也有統(tǒng)計學(xué)差異（*P＜0.05）。②膿毒性休克大鼠模型中自噬的表達(dá)。電鏡下觀察對照組心肌纖維排列整齊，Z線、M線、I帶、A帶清晰可見，相鄰心肌纖維間有較多的線粒體。LPS4小時相鄰心肌纖維間有大量的線粒體，但線粒體嵴多減少、空泡變或外膜破損，可見自噬溶酶體。LPS6小時組心肌纖維肌絲部分?jǐn)U張。相鄰心肌纖維間有較

16、多的線粒體嵴減少或外膜破壞，可見自噬小體。免疫組化結(jié)果顯示，LC3在心肌組織表達(dá)主要定位于心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。鏡下觀察顯示，對照組LC3染色均較少，然而實(shí)驗(yàn)組均可見特異性染色，且給藥4小時組特異性染色明顯增多，且隨著干預(yù)時間的延長，染色逐漸增多。LPS模型中，與對照組相比，給藥組的Beclin1表達(dá)均增多，同時隨著給藥時間的延長Beclin1的表達(dá)出現(xiàn)逐漸增多的趨勢，統(tǒng)計分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05）。LPS模型組的實(shí)驗(yàn)組LC

17、3Ⅱ/LC3Ⅰ比例均比對照組表達(dá)增多，且組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義。mRNA的表達(dá)與蛋白水平相似，隨著給藥的時間延長，LC3Ⅱ和Beclin1的表達(dá)逐漸增多，給藥6小時達(dá)到最多。③LPS誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞自噬及收縮舒張功能的表達(dá)。免疫熒光標(biāo)記的結(jié)果顯示，LC3與SERCA2共同表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞LC3的變化趨勢同大體組織的變化趨勢基本一致，隨著給藥時間的延長LC3逐漸增多。而SERCA2的表達(dá)則與LC3的變化剛好相反，隨著給藥時間

18、的延長SERCA2的表達(dá)逐漸減少。LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中LC3蛋白的表達(dá)較正常對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)，且隨著給藥時間的延長出現(xiàn)逐漸增多的趨勢，這一趨勢與大體心肌組織的表達(dá)基本相同。LPS干預(yù)后SERCA2的表達(dá)較正常對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05）。PLN的表達(dá)則與SERCA2相反，與對照組相比表達(dá)明顯增多。mRNA的表達(dá)同蛋白表達(dá)相似，隨著LPS給藥時間的延長，LC3Ⅱ的表達(dá)逐漸增多，

19、SERCA2的表達(dá)逐漸下降，而PLN則呈現(xiàn)上升的趨勢。④改變自噬活性對心肌細(xì)胞收縮舒張功能的影響。免疫熒光標(biāo)記的結(jié)果顯示，正常細(xì)胞組同時存在一定濃度的LC3和SERCA2的表達(dá)，LPS干預(yù)后，LC3的表達(dá)增多同時SERCA2的表達(dá)減少，而RAPA組的LC3表達(dá)較LPS組更多且SERCA2的表達(dá)減少。3-MA干預(yù)組的LC3表達(dá)較LPS組有所降低，但仍然多于正常對照組，SERCA2的表達(dá)與LPS組相比略有升高。LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中LC

20、3Ⅱ蛋白的表達(dá)較正常對照組明顯增加，而RAPA誘導(dǎo)下LC3Ⅱ的表達(dá)要高于LPS誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05）。之前的研究發(fā)現(xiàn)給予LPS干預(yù)后SERCA2的表達(dá)是下調(diào)的，通過RAPA的誘導(dǎo)SERCA2的表達(dá)出現(xiàn)更低的水平，而PLN的表達(dá)則剛好相反，RAPA干預(yù)后其表達(dá)比LPS組更高。實(shí)驗(yàn)組mRNA水平的表達(dá)基本同蛋白水平的表達(dá)相似，RAPA干預(yù)后SERCA2的表達(dá)較LPS組和正常對照組相比均減少，而PLN的表達(dá)則增高。LPS誘

21、導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)較正常對照組明顯增加，而在3-MA的干預(yù)下LC3Ⅱ的表達(dá)卻低于LPS誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05）。給予LPS后SERCA2的表達(dá)是下調(diào)的，通過3-MA的誘導(dǎo)SERCA2的表達(dá)反而有所增加，但與正常對照組相比未見明顯差別。而PLN的變化也說明了以上問題，3-MA干預(yù)組與LPS組相比PLN的表達(dá)下降，但確未下降至正常對照組的水平。實(shí)驗(yàn)組mRNA水平的表達(dá)基本同蛋白水平的表達(dá)相似，3-MA干預(yù)

22、后SERCA2的表達(dá)較LPS組略有升高，但仍比正常對照組降低，而PLN的表達(dá)則相反，3-MA組比LPS組降低。⑤轉(zhuǎn)染β3-GV358上調(diào)β3-AR基因的表達(dá)對自噬活性及心肌收縮舒張功能的改變。在轉(zhuǎn)染了β3-GV358之后無論加入RAPA和3-MA干預(yù)后發(fā)現(xiàn)β3-AR的變化較β3-GV358組相比均未見明顯異常。β3-GV358組與對照組相比LC3Ⅱ的表達(dá)卻明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05），β3-GV358+RAPA組LC3Ⅱ

23、的水平卻比β3-GV358組的表達(dá)還要高，而β3-GV358+3-MA組LC3Ⅱ的表達(dá)與β3-GV358組相比有所下降但與對照組相比仍然升高。β3-GV358組與對照組相比，SERCA2的表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05），β3-GV358+RAPA組SERCA2的表達(dá)比β3-GV358組還要低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05），β3-GV358+3-MA組SERCA2的表達(dá)與對照組相比仍然略低，但是卻高于β3-GV358組

24、，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)。PLN的表達(dá)則剛好跟SERCA2相反。⑥轉(zhuǎn)染β3-shRNA沉默β3-AR基因的表達(dá)對自噬活性及心肌收縮舒張功能的改變。在轉(zhuǎn)染了β3-shRNA之后無論加入RAPA和3-MA干預(yù)后發(fā)現(xiàn)β3-AR的變化較β3-shRNA組相比均未見明顯異常。β3-shRNA組與對照組相比LC3Ⅱ的表達(dá)卻明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05），β3-shRNA+RAPA組LC3Ⅱ的水平與β3-shRNA組相比略有

25、升高，而β3-shRNA+3-MA組LC3Ⅱ的表達(dá)與β3-shRNA組相比有所下降。β3-shRNA組與對照組相比，SERCA2的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(*P＜0.05)，β3-shRNA+RAPA組和β3-shRNA+3MA組SERCA2的表達(dá)均未見明顯變化，無統(tǒng)計學(xué)意義。PLN的表達(dá)則剛好跟SERCA2相反。
　　結(jié)論：⑴通過靜脈注射LPS方法成功建立膿毒性休克大鼠模型，且隨著給藥時間延長，心肌損傷逐漸加重，左心功能隨

26、時間延長成持續(xù)下降趨勢。⑵LPS誘導(dǎo)大鼠膿毒癥休克后的心肌細(xì)胞自噬活性明顯升高，而且隨著干預(yù)時間延長自噬活性逐漸增強(qiáng)。⑶H9c2心肌細(xì)胞在LPS干預(yù)下也表現(xiàn)出心肌細(xì)胞收縮舒張功能障礙，同樣隨時間延長呈持續(xù)下降趨勢。⑷RAPA可以激活細(xì)胞自噬水平，導(dǎo)致心肌細(xì)胞存活率下降，心肌收縮舒張功能下降。3-MA可以抑制細(xì)胞自噬水平，導(dǎo)致心肌細(xì)胞存活率升高，心肌收縮舒張功能也增強(qiáng)。⑸膿毒癥休克的心功能障礙主要以功能性、一過性改變?yōu)橹?，此時心肌細(xì)胞自噬