甲型流感病毒(H1N1)感染介導(dǎo)的小鼠免疫損傷機(jī)制研究.pdf

1、流感是一種急性呼吸道傳染病，患病率高，在老年和兒童中死亡率很高，世界范圍內(nèi)每年都有大量的流感死亡病例報道，流感對世界公共衛(wèi)生已經(jīng)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。特別是2009年世界范圍內(nèi)暴發(fā)的豬源性甲型流感病毒，傳染性強(qiáng)，波及世界213個國家和地區(qū)，造成了17483例死亡病例，拉響了世界范圍內(nèi)防控流感的警鐘，近期關(guān)于豬源性甲型流感病毒對達(dá)非耐藥的報道，使流感病毒的防控工作更為艱難。
　　 從臨床學(xué)角度分析，甲型流感病毒是流感病毒三個亞型中最為

2、重要的亞型，屬正粘病毒，根據(jù)其表面血凝素(HA)及神經(jīng)氨酸酶(NA)分子的抗原性不同，分別有16(HA)與9(NA)個亞型。病毒基因組的點突變或基因節(jié)段重組將會產(chǎn)生新的變異株，從而引起大范圍的傳染或暴發(fā)性流行。上個世紀(jì)共出現(xiàn)四次流感大流行，最為嚴(yán)重的是1918年的大流感，造成了世界范圍內(nèi)5千多萬人死亡。到目前為止，每年都有一定范圍內(nèi)流感暴發(fā)流行的病例報道。因此，深入研究甲型流感病毒重癥感染的致病機(jī)制，對于選擇抗病毒治療及控制潛在的流感暴

3、發(fā)流行顯得至關(guān)重要。流感病毒致死性感染的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，失控的及異常激活的天然免疫應(yīng)答，和感染過程中大量的巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞快速招募至肺局部是高致病禽流感致病的主要因素，此外巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞與肺部增加的細(xì)胞因子及趨化因子有關(guān)，而升高的細(xì)胞因子水平被認(rèn)為是介導(dǎo)甲型流感病毒病癥的主要原因，亦是決定高致病性禽流感病毒致死性感染癥狀的主要原因。然而，抑制細(xì)胞因子應(yīng)答并不能保護(hù)機(jī)體免于致死性感染，感染早期清除巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞對疾病的結(jié)

4、局亦無顯著影響，這些研究提示巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞在甲型流感病毒重癥感染病例中的復(fù)雜生物學(xué)效應(yīng)。另外，巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞本身也是病毒感染的靶細(xì)胞，巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞被直接感染可能會導(dǎo)致包括抗體應(yīng)答在內(nèi)的獲得性免疫應(yīng)答不能夠被有效激活。
　　 本研究主要探討甲型流感病毒感染介導(dǎo)的小鼠肺免疫損傷機(jī)制，對流感病毒感染Balb/c小鼠后免疫損傷的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸進(jìn)行動態(tài)觀察，分別從細(xì)胞與分子層面揭示流感病毒感染介導(dǎo)的免疫損傷機(jī)制，探討

5、這些免疫細(xì)胞與分子在感染過程中發(fā)揮的雙重作用，同時觀察比較不同毒力病毒感染過程中介導(dǎo)免疫損傷的主要細(xì)胞與免疫分子差異。研究內(nèi)容共分為三部分：1、甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染介導(dǎo)的小鼠肺免疫損傷機(jī)制初步研究，分三節(jié)(1)甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染Balb/C小鼠肺損傷動物模型的建立；(2)甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)感染介導(dǎo)的小鼠肺免疫損傷機(jī)制初探；(3)甲型流感病毒A/PR/8/34(

6、H1N1)感染介導(dǎo)的肺損傷過程中粘膜及二級淋巴器官的免疫應(yīng)答分析；2、甲型流感病毒A/Beijing/501/2009(H1N1)感染介導(dǎo)的小鼠肺損傷機(jī)制初步研究，分三節(jié)(1)甲型流感病毒A/Beijing/501/2009(H1N1)感染Balb/C小鼠肺損傷動物模型的建立；(2)甲型流感病毒A/Beijing/501/2009(H1Nl)感染介導(dǎo)的小鼠肺損傷機(jī)制初探；(3)甲型流感病毒A/Beijing/501/2009(H1Nl)

7、感染介導(dǎo)的肺損傷過程中粘膜及二級淋巴器官的免疫應(yīng)答分析：3、甲型流感病毒A/Beijing/501/2009(H1N1)與A/PR/8/34(H1N1)感染介導(dǎo)的小鼠肺損傷機(jī)制差異分析。
　　 研究結(jié)果：1、兩株病毒感染后小鼠體重變化，死亡率及肺病理變化說明，兩株病毒感染介導(dǎo)的小鼠肺損傷模型建立成功；病毒感染后早期即可在鼻及肺中檢測到病毒復(fù)制，至感染末期，病毒呈持續(xù)性復(fù)制；2、兩株病毒感染造成了小鼠肺損傷的同時，介導(dǎo)了復(fù)雜的應(yīng)答

8、變化，無論是病毒感染早期還是晚期，均檢測到了大量的巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的累積，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，中性粒細(xì)胞與肺病毒載量、肺及血清中抗體應(yīng)答密切相關(guān)，肺中抗體應(yīng)答與肺中病毒載量顯著相關(guān)；病毒感染后巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的浸潤，促進(jìn)了肺細(xì)胞因子應(yīng)答，細(xì)胞因子應(yīng)答參與調(diào)節(jié)抗體應(yīng)答；3、病毒感染過程中，肺部除檢測到較強(qiáng)的抗體應(yīng)答，也檢測到了較強(qiáng)的細(xì)胞因子分泌細(xì)胞應(yīng)答及抗體分泌細(xì)胞應(yīng)答，這兩種應(yīng)答反應(yīng)共同調(diào)節(jié)肺抗體應(yīng)答的強(qiáng)度及維持的時間；4、兩株

9、病毒感染小鼠肺損傷的同時，檢測到了粘膜局部及二級淋巴器官產(chǎn)生了T、B細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，病變累及肺器官的同時，引起了全身免疫系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)，共同參與機(jī)體的免疫防御；5、兩株病毒感染小鼠半數(shù)致死劑量，體重變化及死亡率等指標(biāo)反應(yīng)了兩株病毒在小鼠上的毒力不同，其介導(dǎo)肺免疫損傷過程中誘發(fā)的各種應(yīng)答反應(yīng)規(guī)律不盡相同，總的來說，A/Bcijing/501/2009(H1N1)病毒誘發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)早于A/PR/8/34(H1N1)病毒，強(qiáng)度亦強(qiáng)于后者；6

10、、A/Beijing/501/2009(H1N1)，A/Califomia/04/2009(H1N1)及A/PR/8/34三株病毒蛋白序列比對分析結(jié)果顯示，在已知的重要功能性位點及包括受體結(jié)合區(qū)域在內(nèi)的未知功能性發(fā)生了突變，這些突變與病毒的毒力直接相關(guān)。
　　 結(jié)論：甲型流感病毒感染介導(dǎo)的小鼠肺損傷過程是一個多因素參與的復(fù)雜過程，其中病毒持續(xù)復(fù)制是造成損傷的主要因素之一，肺中大量的巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的累積在感染的早期是損傷的主