馬索羅酚對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠血腦屏障的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:應(yīng)用多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis，MS)國際上公認(rèn)的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental AutoimmuneEncephalomyelitis，EAE)小鼠，研究馬索羅酚(nordihydroguaiaretic acid，NDGA)對EAE小鼠血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的影響及相關(guān)機(jī)制，旨在觀察NDGA對EAE小鼠的治療作用并探究該藥物對于EAE小鼠BB

2、B潛在的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，從而為今后臨床應(yīng)用馬索羅酚輔助治療MS等中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病提供新的理論依據(jù)，尋找臨床治療MS的新靶點(diǎn)。
　　方法:將66只8-10周雌性近交系C57BL/6小鼠(體重為18-20g)，隨機(jī)分為三組:正常對照組、EAE組、馬索羅酚組，其中每組各為22只。各組又分為發(fā)病前給藥組與發(fā)病后給藥組兩個(gè)亞組。其中發(fā)病前給藥組又分為免疫后第8天組、免疫后第14天組兩個(gè)亞組，各亞組2只。發(fā)病后給藥組分為給藥

3、第10天組、給藥第20天組兩個(gè)亞組，其中給藥后第10天組6只，給藥后第20天組12只。免疫小鼠時(shí)應(yīng)用生理鹽水將抗原MOG35-55稀釋成為5mg/ml后，將完全弗氏佐劑（結(jié)核桿菌的終濃度為4mg/ml）按同等體積加入，混合均勻，充分乳化，將小鼠用乙醚麻醉后，固定小鼠，在小鼠脊柱兩側(cè)分四點(diǎn)進(jìn)行皮下注射，每個(gè)點(diǎn)注射0.025ml，總共0.1ml。于免疫當(dāng)天的第0h及第48h分兩次給每只小鼠腹腔注射500ng PTX（1000ng/只）。空白

4、對照組不予免疫。將免疫當(dāng)天記為第0天，發(fā)病前給藥組自免疫第0天開始給予藥物干預(yù)，給予NDGA組每只小鼠NDGA10mg/kg每日腹腔注射;給予EAE組及正常對照組小鼠5％ DMSO10 ml/kg每日腹腔注射。發(fā)病后給藥組待每組動(dòng)物發(fā)病達(dá)1分（15分法）后開始給予NDGA組的每只小鼠NDGA10mg/kg每日腹腔注射;給予EAE組及正常對照組的小鼠5％ DMSO10 ml/kg每日腹腔注射。于動(dòng)物免疫當(dāng)日及免疫后每日上午8:00與下午1

5、7:00對動(dòng)物體重、活動(dòng)狀況、精神狀態(tài)以及皮毛光澤度進(jìn)行觀察，并采用國際通用的15分法評分標(biāo)準(zhǔn)分別對各組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評分。各組小鼠于不同時(shí)間點(diǎn)取材后應(yīng)用熒光顯微鏡法觀察伊文斯蘭染色后血腦屏障通透性的改變，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測小鼠脊髓組織中claudin-5、ZO-1、occludin、MMP-9的表達(dá)情況，應(yīng)用confocal法檢測小鼠腦組織中緊密連接蛋白claudin-5、ZO-1、occludin的表達(dá)與定位情況。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光

6、定量PCR(RT-PCR)法檢測小鼠脊髓組織中MMP-9、NF-κ BmRNA水平的改變情況。
　　結(jié)果:
　　1神經(jīng)功能評分
　　正常對照組小鼠均未發(fā)病。分別比較給藥第10天與給藥第20天EAE組與NDGA組中小鼠的神經(jīng)功能評分均數(shù)。在不同時(shí)間點(diǎn)NDGA組小鼠的神經(jīng)功能評分低于EAE組小鼠的神經(jīng)功能評分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2伊文斯蘭染色結(jié)果
　　發(fā)病前給藥組:給藥第8天EAE組及ND

7、GA組脊髓組織中可見少許的紅色熒光分布于脊膜下，給藥第14天EAE組可見大量的紅色熒光分布于脊膜下，NDGA組的紅色熒光與EAE組相比較分布于脊膜下的較少。而對照組小鼠脊膜下未見明顯的熒光分布。
　　發(fā)病后給藥組:給藥10天組中EAE組小鼠脊髓組織中脊膜下的熒光成斑片狀分布，且熒光強(qiáng)度高，NDGA組與EAE組相比較，熒光范圍較小且強(qiáng)度較弱。給藥后第20天，NDGA組與EAE組伊文斯蘭無論從滲出的量還是從熒光強(qiáng)度上與給藥后第10天組

8、相比較均有不同程度的減少，而NDGA組較EAE組減少得更加明顯。
　　3各組小鼠緊密連接蛋白的表達(dá)情況
　　3.1 claudin-5表達(dá)情況
　　3.1.1免疫組化法檢測給藥后第20d各組小鼠脊髓組織中claudin-5的表達(dá)情況:EAE組小鼠脊髓組織中claudin-5較正常對照組血管內(nèi)皮中的棕黃色顆粒較少且染色較淺、沒有形成連續(xù)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，NDGA組較EAE組表達(dá)明顯增多。
　　3.1.2 confoc

9、al法檢測給藥后第20d各組小鼠腦組織中claudin-5的表達(dá)情況:正常對照組claudin-5陽性細(xì)胞連續(xù)分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中，EAE組與NDGA組claudin-5的連續(xù)性遭到破壞，且排列紊亂，但NDGA組較EAE組連續(xù)性破壞較輕。
　　3.2 occludin的表達(dá)情況
　　3.2.1免疫組化法檢測給藥后第20d各組小鼠脊髓組織中occludin的表達(dá)情況:EAE組小鼠脊髓組織中occludin較正常對照組血管內(nèi)

10、皮中的棕黃色顆粒較少且染色較淺、沒有形成連續(xù)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，NDGA組較EAE組表達(dá)明顯增多。
　　3.2.2 con focal法檢測給藥后第20d各組小鼠腦組織中occludin的表達(dá)情況:正常對照組occludin陽性細(xì)胞連續(xù)分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中，EAE組與NDGA組occludin的連續(xù)性遭到破壞，且排列紊亂，但NDGA組較EAE組緊密連接蛋白的連續(xù)性破壞較輕。
　　3.3 ZO-1的表達(dá)情況
　　3.3.

11、1免疫組化法檢測給藥后第20d各組小鼠脊髓組織中ZO-1的表達(dá)情況:EAE組小鼠脊髓組織中ZO-1較正常對照組血管內(nèi)皮中的棕黃色顆粒較少且染色較淺、沒有形成連續(xù)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，NDGA組較EAE組表達(dá)明顯增多。
　　3.3.2 confocal法檢測給藥后第20天各組小鼠腦組織中ZO-1的表達(dá)情況
　　正常對照組occludin陽性細(xì)胞連續(xù)分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中，EAE組與NDGA組occludin的連續(xù)性遭到破壞，且排列

12、紊亂，但NDGA組較EAE組緊密連接蛋白的連續(xù)性破壞較輕。
　　4各組小鼠MMP-9的表達(dá)情況
　　4.1免疫組化結(jié)果顯示:在給藥后第20天對照組的脊髓組織中均未見明顯的MMP-9陽性細(xì)胞。EAE組與NDGA組的小鼠脊髓組織均可見MMP-9在脊膜細(xì)胞和小血管內(nèi)皮細(xì)胞還有少量在膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)。NDGA組與EAE組相比較，MMP-9陽性細(xì)胞中棕黃色顆粒染色較淺，數(shù)目較少。
　　4.2 RT-PCR檢測給藥后第1

13、0天、第20天脊髓組織中MMP-9 mRNA水平:與正常對照組相比較，EAE組與NDGA組各個(gè)時(shí)間的小鼠的MMP-9mRNA水平均有上調(diào)，其中NDGA組較EAE組表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5各組小鼠NF-κB的表達(dá)情況
　　RT-PCR檢測給藥后第10天、第20天脊髓組織中NF-κB mRNA水平:與正常對照組相比較，EAE組與NDGA組小鼠的NF-κB mRNA水平均有上調(diào)，NDGA組較EAE組