家蠶核型多角體病毒基因gp41及da26的融合表達(dá).pdf

1、家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrin virus，BmNPV)是桿狀病毒中研究較為深入的一種病毒，在BmNPV的生活周期中，產(chǎn)生兩種病毒形態(tài)包涵體病毒(Occluded virus，OV)和芽生型病毒(Budded virus，BV)，這兩種病毒形態(tài)在病毒致病機(jī)理上起著不同的作用。BV和OV雖然在遺傳學(xué)上相同，但組成其囊膜的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)不同，這對各自的組織定向性具有重要性。gp41基因是目前已獲

2、得全基因組的桿狀病毒中都保守存在的基因，其蛋白產(chǎn)物GP41僅存在于ODV中，并定位于包涵體病毒囊膜和核衣殼之間。da26基因不保守，只存在于幾種桿狀病毒中，其蛋白產(chǎn)物BV/ODV-E26(E26)為囊膜蛋白，同時(shí)存在于BV和ODV中。gp41和da26是BmNPV中與病毒結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因。為了更深入的了解gp41和da26基因在BmNPV中的結(jié)構(gòu)與功能，我們就gp41和da26基因在家蠶BmN細(xì)胞中的表達(dá)特征及相關(guān)功能開展了研究，主要研究

3、結(jié)果如下：
　　 為了研究BmNPV中GP41蛋白的包裝功能，從BmNPV基因組中克隆了gp41基因，并將其克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-GFP中，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-gp41-GFP；利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac)篩選重組桿狀病毒，在家蠶細(xì)胞系BmN中進(jìn)行了融合表達(dá)和定位研究。SDS-PAGE和Western-blot檢測結(jié)果顯示，融合蛋白的大小為65kD左右，證明該融合蛋白在BmN中

4、成功表達(dá)。熒光顯微鏡的觀察表明，綠色熒光充滿在細(xì)胞質(zhì)中，不能形成聚集體；與野生型BmNPV混合感染的實(shí)驗(yàn)也表明，熒光出現(xiàn)的位置與多角體無關(guān)，說明GP41-GFP蛋白不能附著在多角體表面，融合表達(dá)可能影響了GP41蛋白與多角體的結(jié)合。
　　 啟動子polh的調(diào)控下，DA26蛋白的表達(dá)研究。我們從BmNPV基因組中克隆了da26基因，并將其克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-GFP中，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacl-da2

5、6-GFP；利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bac-to-Bac)篩選重組桿狀病毒，在家蠶細(xì)胞系BmN中進(jìn)行了融合表達(dá)。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)融合蛋白DA26-GFP在細(xì)胞中呈顆粒狀分布，單個細(xì)胞中顆粒數(shù)不等。由于DA26蛋白具有易被洗脫劑或去污劑洗脫的特點(diǎn)，根據(jù)此特征，我們對DA26蛋白進(jìn)行了純化。將純化的DA26-GFP蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，發(fā)現(xiàn)一些與DA26蛋白相關(guān)的蛋白條帶。將感興趣的條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析得出其相應(yīng)基因?yàn)関p39和bro-li

6、ke。推測BmNPV DA26基因可能與bro-like，VP39及肌動蛋白形成復(fù)合物，參與與病毒復(fù)制或蛋白水解等有關(guān)的活動。
　　 近年來，對BmNPV的分子生物學(xué)研究倍受重視，并取得了迅速的發(fā)展，但BmNPV大多數(shù)基因的功能都是根據(jù)苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒同源基因的功能推斷而來，到目前為止確定功能的基因只有少數(shù)。gp41和da26基因是與病毒結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因，該種基因決定了病毒入侵宿主細(xì)胞的方式和能力，對病毒的繁殖有著重要的