姜黃素衍生物對大鼠肝星狀細胞作用的體外研究.pdf

1、目的:觀察姜黃素衍生物(Curc-OEG)抑制原代大鼠肝星狀細胞(HSC)增殖、活化以及誘導(dǎo)其凋亡的作用，探討其可能的作用機制。
　　方法:(1)采用Ⅳ型膠原酶、DNA酶消化SD雄性大鼠肝臟，percoll梯度離心得到原代肝星狀細胞;FAP、desmin、α-SMA、collagenⅠ、vimentin及β-actin免疫組化鑒定肝星狀細胞，流式鑒定剛分離和傳代后細胞的純度。
　　(2)檢測姜黃素衍生物抑制原代肝星狀細胞增殖

2、、活化的作用及其機制:細胞分離后1天分別加入0、6.25、12.5μg/ml濃度的姜黃素衍生物。倒置顯微鏡下觀察加藥后1、4、7天的細胞形態(tài)學(xué)變化;作用7天后用RT-PCR及Western blot檢測α-SMA、collagenⅠ、TGF-β1及Smad2的表達水平。
　　(3)檢測姜黃素衍生物誘導(dǎo)活化的肝星狀細胞凋亡的作用及其機制:活化的肝星狀細胞在第14天分別加入0、6.25、12.5、25、50、75μg/ml濃度的姜黃素

3、衍生物。倒置顯微鏡下觀察加藥后24h的細胞形態(tài)學(xué)變化;AnnexinⅤ FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測凋亡率;作用24;后用RT-PCR檢測白蛋白，凋亡基因Bax、Bcl-2、P53的mRNA水平，纖維化相關(guān)基因α-SMA、cllagenⅠ、collagenⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3、PDGF-βR、NF-κB、PPAR-γ、TIMP-1、TIMP-2及MMP-13的mRNA水平。
　　結(jié)果:(1)肝星狀細胞得率為

4、4.0-5.0×107，臺盼蘭染色顯示細胞存活率在90％以上;免疫組化結(jié)果顯示隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，desmin、α-SMA、 collagenⅠ、vimentin及β-actin的表達增強，而GFAP的表達減弱;流式結(jié)果顯示剛分離和培養(yǎng)第14天的肝星狀細胞純度分別為56％和96％。
　　(2)低濃度的姜黃素衍生物可以明顯抑制原代肝星狀細胞增殖和活化。原代肝星狀細胞在藥物作用7天后，與對照組相比，6.25μg/ml和12.5μg/m

5、l濃度藥物處理組細胞數(shù)目分別減少了55％和85％;在12.5μg/ml濃度藥物作用下，原代肝星狀細胞α-SMA、collagenⅠ、TGF-β1及Smad2的mRNA表達水平分別下調(diào)83％、77％、85％及75％(P＜0.05)，蛋白表達水平分別下調(diào)94％、82％、92％及73％(P＜0.05)。
　　(3)姜黃素衍生物可以促進活化的肝星狀細胞凋亡?；罨母涡菭罴毎谒幬镒饔?4h后，流式結(jié)果顯示細胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而遞增

6、;與對照組相比較，在50μg/ml濃度藥物作用下，活化的肝星狀細胞Bax的mRNA表達水平上調(diào)約2.3倍，Bcl-2的mRNA表達水平下調(diào)約5.6倍，而原代肝細胞白蛋白mRNA表達無明顯變化;此外，姜黃素衍生物還可以上調(diào)PPAR-γ，下調(diào)纖維化相關(guān)基因α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3、PDGF-β R、NF-κB、TIMP-1及TIMP-2的mRNA表達水平。
　　結(jié)論:Cu