家蠶幾丁質(zhì)酶與幾丁質(zhì)合成酶的基因表達(dá)與功能研究.pdf

1、幾丁質(zhì)是昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物、線蟲和真菌特有的一類重要生物多聚物，支持昆蟲表皮、氣管以及腸上皮圍食膜的角質(zhì)層。幾丁質(zhì)代謝依賴兩種幾丁質(zhì)合成酶和幾丁質(zhì)降解酶，及其與生物體發(fā)育相適應(yīng)的嚴(yán)格的幾丁質(zhì)的合成與降解的協(xié)調(diào)。昆蟲生長與變態(tài)嚴(yán)格依賴于含有幾丁質(zhì)的組織器官的結(jié)構(gòu)改變能力，控制昆蟲等無脊椎動(dòng)物的幾丁質(zhì)合成和降解，就有可能實(shí)現(xiàn)對其生長發(fā)育，甚至是生命的控制。因此，幾丁質(zhì)合成和降解的控制成為專一性新型殺蟲劑和殺菌劑的研究熱點(diǎn)。
　　 60％

2、以上的農(nóng)業(yè)害蟲屬于鱗翅目，其安全高效的防治方法研究具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。本文依靠家蠶基因組數(shù)據(jù)庫資源，利用分子克隆、RACE、生物信息學(xué)、RNAi等技術(shù)手段，對鱗翅目模式昆蟲家蠶的幾丁質(zhì)合成酶同源基因BmChsA與BmChsB，以及幾丁質(zhì)酶基因BmChi-h和BmCht，進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下：
　　 1.首次在家蠶中克隆出幾丁質(zhì)合成酶同源基因BmChsA與BmChsB的cDNA片段，長度分別為4943bp，3055bp。時(shí)空表

3、達(dá)調(diào)查結(jié)果顯示BmChsA基因特異性在幼蟲頭部和體壁組織大量表達(dá)，而BmChsB基因主要在中腸組織大量表達(dá)；在蛻皮期BmChsA基因表達(dá)水平上調(diào)，而BmChsB基因表達(dá)水平下調(diào)。
　　 2.RNAi的研究發(fā)現(xiàn)，3齡將眠蠶注射5μg/頭的BmChsA基因的dsRNA或siRNA，注射后36 h，分別出現(xiàn)了10％和40％的蛻皮異常的個(gè)體。蛻皮異常的幼蟲表現(xiàn)為個(gè)體變小、半蛻皮和不蛻皮三種。蛻皮異常幼蟲表皮的BmChsA基因轉(zhuǎn)錄水平也被

4、顯著下調(diào)，其中siRNA處理的效果顯著好于dsRNA處理。4齡起蠶注射家蠶幾丁質(zhì)酶BmChi-h基因和.BreCht基因的5μg dsRNA/頭，沒有獲得表型異常的個(gè)體。
　　 3.家蠶4齡起蠶注射20羥蛻皮甾酮(20E)后，12 h后即出現(xiàn)舊表皮溶解、新表皮再生現(xiàn)象，36h即出現(xiàn)蛻皮前兆，在60h部分個(gè)體已經(jīng)完成蛻皮，比對照組和保幼激素類似物Methoprene處理蠶提早了36h，而Methoprene涂抹處理后家蠶4齡幼蟲的

5、生長發(fā)育與對照沒有出現(xiàn)明顯差異。
　　 4.家蠶4齡起蠶激素處理后基因表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，20E顯著上調(diào)了幼蟲頭部與表皮的幾丁質(zhì)酶基因BmChi-h和BmCht的表達(dá)水平，短時(shí)間抑制幾丁質(zhì)合成酶基因BmChsA與BmChsB的表達(dá)水平，這種抑制在處理后30 h以后得到恢復(fù)。Methoprene處理對幾丁質(zhì)合成酶基因BmChsA與BmChsB的表達(dá)影響不同，暗示其代謝調(diào)控機(jī)制可能存在差異。
　　 5.在不同外源激素誘導(dǎo)的生理狀態(tài)下

6、，家蠶頭部與體壁的幾丁質(zhì)酶基因BmChi-h基因和BmCht基因維持了極為相似的變化趨勢，說明這兩個(gè)基因在家蠶體內(nèi)發(fā)揮著極為相似的作用。家蠶幾丁質(zhì)合成酶BmChsA在幼蟲頭部與體壁特異性表達(dá)、BmChsB只在體壁特異表達(dá)；在家蠶4齡幼蟲體壁中，BmChsA基因表達(dá)水平一直高于BmChsB基因，但4L-60 h幼蟲接近入眠時(shí)，BmChsB基因的表達(dá)被Methoprene處理抑制，而20E幾乎同時(shí)顯著提高了4L-36 h后幼蟲體壁中BmCh