青花菜軟腐病病程的cDNA-AFLP差異表達(dá)分析.pdf

1、青花菜（Brassica oleracea L. Var. Italica）屬十字花科（Cruciferae）、蕓薹屬（Brassica）、甘藍(lán)種（Brassica species）。青花菜食用部分是其分化花蕾組成的花球及鮮嫩的花莖，不僅風(fēng)味鮮美，營(yíng)養(yǎng)也特別豐富，除含有較高的蛋白質(zhì)及維生素外，還含有β胡蘿卜素、吲哚等有利于人體健康的微量元素和抗癌物質(zhì)。軟腐病常發(fā)生在青花菜的生長(zhǎng)、運(yùn)輸、貯藏等過(guò)程，是十字花科蔬菜的主要病害之一，其致病菌為

2、歐文氏胡蘿卜亞種。本試驗(yàn)用軟腐病病原菌接種青花菜葉片，在接種后0-7 h，每小時(shí)取一次樣，測(cè)定其生理指標(biāo)。取第0 h、1 h、4 h、7 h的材料應(yīng)用 cDNA-AFLP技術(shù)研究分析青花菜感病過(guò)程中差異表達(dá)基因，并利用RACE克隆技術(shù)克隆獲得LRR、WRKY兩條基因的cDNA。
　　1、開(kāi)展了軟腐病病程相關(guān)的活性氧代謝研究。結(jié)果表明，隨著感病時(shí)間的推移，細(xì)胞膜透性、MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，SOD、POD呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(shì)

3、， CAT酶活性變化不大，說(shuō)明活性氧代謝在青花菜對(duì)軟腐病病源菌的響應(yīng)中起到一定的作用。SOD、POD在低濃度時(shí)增強(qiáng)青花菜對(duì)病原菌的抗性，高濃度時(shí)降低青花菜對(duì)病原菌的抗性。
　　2、建立了青花菜cDNA-AFLP反應(yīng)體系，20μL體系各個(gè)組分最佳用量為：模板用量為40 ng、引物用量為0.4μmol·μL-1、dNTP用量為0.2 mmol·L-1、Ex-Taq酶用量為0.5 U。
　　3、開(kāi)展了青花菜感病過(guò)程中差異表達(dá)基因

4、cDNA-AFLP。應(yīng)用了128對(duì)引物，最終獲得了102條TDFs，測(cè)序成功91個(gè)，將這些序列在VecScreen中去載體，在NCBI里進(jìn)行Blast，比對(duì)結(jié)果顯示：同源性較低的序列5個(gè)，來(lái)源物種為細(xì)菌的序列5個(gè)，來(lái)源為動(dòng)物序列的1個(gè)，最后得到80個(gè)同源性較高的差異片段基因。根據(jù)功能的不同，初步將其分為8類(lèi)：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、抗病相關(guān)基因、生物合成關(guān)鍵酶基因、蛋白質(zhì)合成與修飾相關(guān)基因、逆境響應(yīng)相關(guān)基因、代謝途徑相關(guān)酶類(lèi)基因、轉(zhuǎn)錄因子以及

5、一些其它未知功能的基因。
　　4、克隆了LRR、WRKY的cDNA。其中LRR基因cDNA全長(zhǎng)1235 bp，開(kāi)放閱讀框共有903個(gè)堿基組成，編碼301個(gè)氨基酸，在GenBank上登錄號(hào)為：KC476519，該基因?qū)儆赗基因，通過(guò)對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)推測(cè)其具為T(mén)M結(jié)構(gòu)域、胞外LRR結(jié)構(gòu)域和絲/蘇氨酸激酶位點(diǎn)。WRKY基因 cDNA全長(zhǎng)為1710 bp，開(kāi)放閱讀框共有1500個(gè)堿基組成，編碼500個(gè)氨基酸，在GenBank上登錄號(hào)為：