轉(zhuǎn)HaTLP基因抗蟲棉花的培育與鑒定.pdf

1、棉花（Gossypium hirsutum L.）是世界性的最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。蟲害是棉花增產(chǎn)的主要限制因素之一，轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲棉為害蟲防治提供了一個行之有效的方法。近年來，棉花抗蟲基因工程發(fā)展迅速，一系列抗蟲基因工程植株相繼產(chǎn)生。其中，轉(zhuǎn)基因Bt棉的大面積種植和商品化生產(chǎn)，為提高棉花產(chǎn)量，減少農(nóng)藥污染做出了重要的貢獻(xiàn)，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益。然而，隨著Bt棉的大面積種植，害蟲對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性的問題越來越引起人們的

2、關(guān)注。因此，尋找新的有效抗蟲基因，同時開發(fā)更新更安全的抗蟲方法，成為了棉花抗蟲育種工作的重要任務(wù)之一。
　　類胰蛋白酶是昆蟲中腸內(nèi)的一種主要的蛋白水解酶，屬于絲氨酸蛋白酶家族，被認(rèn)為是肽鏈內(nèi)切酶，具有高度的專一性，特異性識別精氨酸或者賴氨酸的羧基與其他氨基酸的氨基脫水生成的肽鍵，同時可以迅速激活其他蛋白酶原而行使其消化蛋功能。昆蟲體內(nèi)類胰蛋白酶的減少或缺失，會阻滯昆蟲的生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致昆蟲死亡。為了研究類胰蛋白酶靶基因沉默后產(chǎn)生

3、的抗蟲效果，我們采用RNA干擾技術(shù)，沉默棉鈴蟲體內(nèi)的類胰蛋白酶基因，以此創(chuàng)制出棉花抗蟲新材料。
　　本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化下胚軸法將包含HaTLP基因的RNA干擾載體（pCAMBIA2300∷HaTLPRNAi）轉(zhuǎn)入棉花W0品系，經(jīng)組織培養(yǎng)再生共得到89個克隆的再生轉(zhuǎn)基因株系。對所有轉(zhuǎn)基因株系的再生植株進(jìn)行DNA提取，用啟動子與目的基因組合的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步得到54個陽性克隆的再生植株，陽性率為60.67％。嫁接成活

4、后，得到了45個克隆的T0代轉(zhuǎn)基因株系。陽性植株自交后，收獲了17個克隆的T0代種子，其中一個T0代轉(zhuǎn)基因株系現(xiàn)已得到34株T1代植株。對T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了室內(nèi)卡那霉素抗性鑒定與PCR分子檢測，篩選得到20株陽性植株。
　　為進(jìn)一步檢測表達(dá)轉(zhuǎn)HaTLP基因片段dsRNA的棉花植株的抗蟲性，我們對獲得的部分轉(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)行了人工接蟲處理。T0代轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲能力得到了大大的提高。與對照相比，轉(zhuǎn)