以海藻酸鈉-氧化石墨烯為載體的固定化酶的研制及應(yīng)用.pdf

1、海藻酸鈉(SA)是從褐藻中提取出的天然多糖，它具有無毒，親水性強(qiáng)，生物相容性好，成本低的特點，經(jīng)常被用來作為固定化酶的載體材料。然而SA也有一些缺陷，比如，親水性太強(qiáng)，機(jī)械性能和熱穩(wěn)定性比較差。這在很大程度上限制了其應(yīng)用。一個有效的解決問題的方法是把SA和有機(jī)或者無機(jī)材料復(fù)合起來。氧化石墨烯(GO)因其成本低、表面積大，機(jī)械強(qiáng)度高而備受關(guān)注。GO具有大量的不同類型的含氧官能團(tuán)（羥基、環(huán)氧基、羰基、羧基等），同時GO也是一種好的固定化酶的

2、載體材料。把SA和GO復(fù)合起來，不僅能提高SA的熱穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，還能提高酶的固定化的效果。本研究先用凝膠法制備SA/GO小球，然后用二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化SA/GO小球，再用活化的SA/GO小球分別制備固定化果膠酶(I-P)，共固定化果膠酶和糖化酶(I-PG)，對I-P和I-PG的制備條件和參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化研究。最后把I-PG應(yīng)用于南瓜-山楂復(fù)合汁的制備中。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　

3、1.分別用戊二醛、環(huán)氧氯丙烷、DCC/NHS三種不同的活化劑活化SA/GO小球，結(jié)果表明:DCC/NHS活化的SA/GO(4％wt GO)小球制備的固定化酶效果最好。通過單因素和響應(yīng)面分析(RSM)果膠酶的最佳固定化條件為:酶濃度為10.24 mg/mL，pH為3.0，溫度為30℃，時間為30 min。驗證試驗表明，以此固定化工藝制備的果膠酶活力為1236.86±40.21 U/g。
　　2.通過傅里葉-紅外變換光譜(FT-IR)

4、對固定化前后載體分子的基團(tuán)變化分析和掃描電鏡(SEM)對表面的微觀結(jié)構(gòu)變化的觀察，結(jié)果表明SA和GO相容性好，活化和固定化均發(fā)生在載體表面。DCC/NHS活化的SA/GO小球通過共價鍵（酰胺鍵）固定果膠酶。熱重分析得知:SA/GO的熱穩(wěn)定性比SA強(qiáng)。以果膠為底物，對I-P的酶學(xué)特性研究表明:I-P的反應(yīng)動力學(xué)遵循米氏方程;I-P的米氏常數(shù)(Kml=7.71mg/mL)略大于游離果膠酶(Km=6.73 mg/mL)。I-P的最適pH為4.

5、0，與游離果膠酶的最適pH相比，向酸性偏移;I-P的最適溫度為60℃，I-P的最適溫度比游離酶增大。此外，I-P的熱穩(wěn)定性優(yōu)于游離果膠酶。重復(fù)使用6次，相對酶活力仍可以保持在70％以上，I-P的重復(fù)利用性好。
　　3.通過單因素和正交實驗分析，確定I-PG的最佳共固定化條件為:pH4.0，溫度40℃，時間35 min。對I-PG酶學(xué)特性的研究表明:I-PG的最適pH為4.5，I-PG中果膠酶和糖化酶的最適pH均向酸性偏移。I-PG

6、的最適溫度為60℃，比游離酶最適溫度增大。此外，I-PG的熱穩(wěn)定性提高，I-PG重復(fù)使用6次，相對酶活仍能保持在60％以上。
　　4.以可溶性固形物(TSS)、透光率、還原糖含量為指標(biāo)，通過單因素和正交實驗分析，確定I-PG的最佳酶解工藝參數(shù)為:加酶量0.5g/100 mL、時間為90 min、溫度為60℃。驗證實驗表明:以此酶解工藝參數(shù)酶解南瓜-山楂復(fù)合汁，得到的南瓜-山楂復(fù)合汁中可溶性固形物含量為5.4±0.1％，透光率為94