不同類(lèi)型玉米胚乳轉(zhuǎn)錄組及其淀粉代謝相關(guān)基因分析.pdf

1、玉米是重要的糧飼和工業(yè)原料作物，玉米胚乳占籽粒重量的80％-85%，胚乳細(xì)胞的發(fā)育、增殖和充實(shí)情況決定了籽粒的重量和品質(zhì)，深入研究玉米胚乳發(fā)育及形成過(guò)程對(duì)提高玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的意義。本研究以高直鏈玉米（T1）、甜玉米（T2）、糯玉米（T3）和普通玉米（T4）四種籽粒胚乳淀粉組成不同的玉米自交系胚乳為材料，采用基于 Ilumilla/Solexa測(cè)序的 RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建了不同玉米自交系胚乳的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，篩選了不同自交系玉米胚

2、乳差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因的COG功能分類(lèi)、GO顯著富集和Pathway顯著富集進(jìn)行了分析，同時(shí)對(duì)胚乳發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分析篩選及候選基因的克隆主要研究結(jié)果如下：
　　1.應(yīng)用 Illumina/Solexa測(cè)序平臺(tái)對(duì)高直鏈、甜、糯和普通玉米胚乳進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別獲得21,127,794、18,139,530、18,292,192和20,041,927個(gè)clean read，參照B73基因組分析模式，拼接組裝共獲得43

3、540個(gè)基因。通過(guò)插入片段檢驗(yàn)、比對(duì)統(tǒng)計(jì)分析、cDNA片段隨機(jī)性實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)和基因覆蓋度統(tǒng)計(jì)等質(zhì)量評(píng)估表明Solexa測(cè)序質(zhì)量滿(mǎn)足后續(xù)各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析。
　　2.對(duì)玉米不同自交系胚乳的基因進(jìn)行可變剪接事件的分析得出，不同類(lèi)型玉米胚乳基因主要以外顯子跳躍（Exon skipping）和內(nèi)含子滯留（Intron retention）的方式進(jìn)行可變剪接。高直鏈、甜、糯玉米胚乳發(fā)生可變剪接的基因數(shù)目和事件要明顯高于普通玉米胚乳，說(shuō)明高直鏈、甜、糯

4、玉米胚乳轉(zhuǎn)錄組組分及其相對(duì)豐度發(fā)生較大差異，這些差異的基因和可變剪接模式可能在胚乳發(fā)育過(guò)程中影響其基因表達(dá)。同時(shí)篩選得到9個(gè)剪接調(diào)控因子（SR），SR基因主要高表達(dá)于高直鏈玉米胚乳和糯玉米胚乳中，表明直鏈淀粉和支鏈淀粉的形成過(guò)程中相關(guān)基因的剪接大多受其調(diào)控。在淀粉合成途徑中ADPase酶類(lèi)、分支酶類(lèi)和去分支酶類(lèi)大多數(shù)基因在不同自交系中均未發(fā)生可變剪接，表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，部分基因在不同自交系中其剪接及方式表現(xiàn)出差異如ZmBEIIb(ae

5、)只在糯玉米胚乳中以3’端位點(diǎn)的可變剪接（Alternative3'splice site）方式進(jìn)行可變剪接、ZmAGPL1(sh2)只在甜玉米中以末位外顯子剪接方式進(jìn)行可變剪接（Alternative last exon），這些剪接差異可能與淀粉合成及其組成差異相關(guān)。
　　3.玉米胚乳的形成與灌漿期籽粒細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞、細(xì)胞防御、抗氧化平衡、碳代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白降解等基因功能類(lèi)群和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑密切相關(guān)?；虮磉_(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，以普

6、通玉米為參比，高直鏈、甜和糯玉米胚乳中極顯著差異表達(dá)基因（P<0.01）525個(gè)，其中上調(diào)的有324個(gè)，下調(diào)的有201個(gè)。結(jié)合差異基因的相關(guān)功能注釋?zhuān)瑢⒋?25個(gè)差異表達(dá)基因分為15個(gè)功能類(lèi)別，其中有6個(gè)是主要功能類(lèi)別基因群（信號(hào)傳遞、細(xì)胞防御、抗氧化平衡、碳代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白質(zhì)降解），說(shuō)明玉米不同胚乳的形成可能與這些主要功能類(lèi)別基因群和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑密切相關(guān)。
　　4.構(gòu)建了差異表達(dá)基因淀粉代謝的 Pathway，以普通玉米胚乳

7、為對(duì)照，高直鏈、甜和糯玉米胚乳分別篩選得到19個(gè)、17個(gè)和24個(gè)差異表達(dá)基因，主要涉及淀粉合成過(guò)程中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶（直鏈淀粉合成酶和支鏈淀粉合成酶）、淀粉分支酶及淀粉去分支酶。高直鏈胚乳中ZmGBSSIIb的表達(dá)量要明顯高于普通玉米胚乳，表明高直鏈玉米胚乳中直鏈淀粉合成能力要高于普通玉米；此外，可溶性淀粉合成酶ZmSSI、ZmSSIIa、ZmSSIIb、和ZmSSIV高表達(dá)于糯玉米胚乳中，表明不同亞型的可溶性淀粉合

8、成酶在支鏈淀粉合成中發(fā)揮的催化作用不同，且共同負(fù)責(zé)支鏈淀粉的合成。此外在甜玉米胚乳中 ADPG焦磷酸化酶ZmAGPL3和ZmAGPL1（sh2）的表達(dá)量明顯低于普通玉米胚乳，表明在淀粉合成過(guò)程中 ADPG焦磷酸化酶活性抑制或喪失，從而阻礙甜玉米胚乳中淀粉的積累，促進(jìn)可溶性糖的形成。
　　5.通過(guò)篩選差異表達(dá)基因一共獲得100個(gè)轉(zhuǎn)錄因子涉及19個(gè)主要的轉(zhuǎn)錄因子家族，進(jìn)一步構(gòu)建了這些轉(zhuǎn)錄因子與淀粉合成相關(guān)基因的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)合差異

9、表達(dá)基因在不同類(lèi)型玉米胚乳中的表達(dá)模式，篩選得到5個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，并從玉米自交系 B73中克隆了位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心位置的基因 ZmNAC116，通過(guò)SDS-PAGE分析該蛋白大小與預(yù)測(cè)大小相近，在上清中的表達(dá)量要高于沉淀。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn) ZmNAC116基因只在種子中表達(dá)，且在胚乳中的表達(dá)量很高。通過(guò)基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)分析顯示，ZmNAC116-GFP融合表達(dá)蛋白定位在細(xì)胞核中。過(guò)量表達(dá) ZmNAC116的轉(zhuǎn)基因水稻在生長(zhǎng)表

10、型上與對(duì)照植株沒(méi)有明顯差異。
　　綜上所述，本文利用 RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建了不同類(lèi)型玉米胚乳轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，篩選了差異表達(dá)基因，并對(duì)差異表達(dá)基因的GO和Pathway顯著富集進(jìn)行了分析，獲得了與胚乳形成有關(guān)的顯著富集條目，利用差異表達(dá)基因在不同類(lèi)型玉米胚乳中的表達(dá)模式結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子與淀粉合成相關(guān)基因的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)篩選獲得并克隆了ZmNAC116，并對(duì)其分子生物學(xué)特性進(jìn)行分析。本研究為玉米胚乳形成和淀粉合成的分子機(jī)制奠定了一定理論基礎(chǔ)