間歇性低氧對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響及可能機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的：
　　非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一類除酒精和其他明確因素影響，以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征[1-2]。近來有文獻(xiàn)報(bào)道，睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(sleepuapnea-hypopnea syndrome，SAHS)患者肝細(xì)胞內(nèi)有異常的脂質(zhì)沉積，認(rèn)為慢性睡眠呼吸暫停綜合征所致的間歇性低氧(intermenthypoxia，I

2、H)可以誘發(fā)肝細(xì)胞脂質(zhì)異常代謝[3]，目前有關(guān)間歇性低氧與肝細(xì)胞脂代謝之間的關(guān)系鮮見研究報(bào)道?；钚匝?reactive oxygenspecies，ROS)、低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factors，HIFs)是調(diào)控哺乳動(dòng)物適應(yīng)低氧環(huán)境的重要因子，脂肪分化相關(guān)蛋白(adiposedifferentiation-related protein，adipophilin ADFP)、固醇調(diào)節(jié)原件結(jié)合蛋白（sterol

3、regulatory element binding protein，SREBP）-1c、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)是調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和合成的關(guān)鍵分子。本實(shí)驗(yàn)擬用三氣培養(yǎng)箱、人正常肝細(xì)胞(LO2)、肝癌細(xì)胞(HepG2)建立間歇性低氧細(xì)胞模型，探討間歇性低氧對(duì)肝細(xì)胞脂代謝及相關(guān)分子的影響，旨在為治療和預(yù)防NAFLD提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組(21％ O2)

4、、實(shí)驗(yàn)組（間歇性低氧組）
　　2、建立間歇性低氧細(xì)胞模型:在三氣培養(yǎng)箱中用不同氧濃度(1％O2、2％O2、3％O2、21％O2)培養(yǎng)人肝LO2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞持續(xù)8h/d，相繼處理1、2、3、4、5、6d，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力，甘油三酯試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量;油紅O染色觀察肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況。
　　3、western-blot方法檢測(cè)HIF-1α、HIF-2α、ADFP、SREBP-1c

5、、FAS在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
　　4、活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ROS在LO2、HepG2細(xì)胞內(nèi)含量的變化。
　　結(jié)果：
　　第一部分間歇性低氧誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)異常沉積
　　1、低氧濃度的篩選:MTT方法檢測(cè)1％O2、2％O2、3％O2、21％O2對(duì)HepG2、LO2細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果示:經(jīng)上述干預(yù)，1％O2條件下，6d后細(xì)胞存活率小于50％，2％O2、3％O2條件下6d后的細(xì)胞存活率約100％,根據(jù)相關(guān)參考文鮮[19

6、，15]，選擇2％O2、3％O2進(jìn)行后續(xù)篩選。
　　2、間歇性低氧時(shí)間點(diǎn)篩選:甘油三酯試劑盒檢測(cè)2％O2、3％O2對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)TG的影響，結(jié)果示:2％O2、3％O2低氧處理組隨時(shí)間延長(zhǎng)，各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)TG含量逐漸增加，至第5d達(dá)高峰;相同對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)2％O2低氧組肝細(xì)胞內(nèi)TG含量較3％O2低氧組明顯升高(LO2:78.7±2.73vs56.2±1.73,t=13.92, p＜0.05; HepG2:96.4±3.67vs88.37±2

7、.36，t=3.68，p＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此選用2％O2為最佳低氧濃度，1、2、3、4、5d為低氧處理時(shí)間。
　　3、肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)檢測(cè)
　　(1)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組肝細(xì)胞TG含量無明顯變化(FLO2=0.6，P=0.67＞0.05; FHepG2=0.82，P=0.53＞0.05)，經(jīng)2％O2間歇性低氧干擾后，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)TG含量逐漸增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FLO2=61.83, P＜0.01;

8、FHepG2=104.19, P＜0.01)。
　　(2)油紅O染色:與對(duì)照組相比較，經(jīng)間歇性低氧處理后LO2和HepG2細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)橘紅色脂滴隨時(shí)間延長(zhǎng)增多并出現(xiàn)融合現(xiàn)象。
　　第二部分間歇性低氧對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝影響的可能機(jī)制
　　1、肝細(xì)胞內(nèi)HIF-1α、HIF-2α的蛋白表達(dá)變化
　　經(jīng)2％O2持續(xù)干擾8h/d，分別依次處理1、2、3、4、5d后，HIF-1α、HIF-2α在第1d表達(dá)量較對(duì)照組明顯增多(P＜

9、0.05)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)HIF-1α的表達(dá)量逐漸增多(FLO2=371.19，F(xiàn)HepG2=150.84，P＜0.05)，HIF-2α的表達(dá)卻逐漸下降，至低氧干預(yù)第4天低于對(duì)照組水平(tLO2=3.18, tHepG2=2.54, P＜0.05)。
　　2、 LO2和HepG2細(xì)胞中ROS的變化
　　實(shí)驗(yàn)組LO2和HepG2細(xì)胞內(nèi)的ROS含量較對(duì)照組增多(tLO2=22.06，tHepG2=7.2，P＜0.05)并呈時(shí)

10、間依賴性增多(FLO2=1021.84，F(xiàn)HepG2=49.89，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、肝細(xì)胞內(nèi)SREBP-1c、FAS、ADFP分子的表達(dá)
　　與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組第2d，SREBP-1c、FAS和ADFP蛋白表達(dá)開始升高(LO2:tSREBP-1c=5.83，tFAS=9.84，tADFP=19.99，P＜0.05;HepG2:tSREBP-1c=8.4，tFAS=9.18，tADFP=5.46，P

11、＜0.05)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增多，(FLO2,SREBP-1c=204.49，F(xiàn)LO2,FAS=38.2，F(xiàn)LO2,ADFP=154.31，P＜0.05;FHepG2,SREBP-1c=107.35, FHepG2,FAS=279.71, FHepG2,ADFP.=352.06, P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、間歇性低氧可以誘導(dǎo)LO2和HepG2細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)異常沉積
　　2、間歇性低氧