非天然氨基酸定位的酶生物正交固定化研究.pdf

1、酶固定化技術(shù)在保持酶穩(wěn)定性、活性可調(diào)節(jié)、易回收再利用等方面表現(xiàn)突出，其應(yīng)用前景廣闊。傳統(tǒng)的共價(jià)固定方法需要使用戊二醛和對(duì)苯醌等交聯(lián)劑，且存在酶需要純化、環(huán)境污染大、耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，最為嚴(yán)重的是共價(jià)連接主要依賴肽鏈中天然氨基酸側(cè)鏈氨基，且連接反應(yīng)隨機(jī)發(fā)生，酶活性位點(diǎn)常因其中的錯(cuò)誤連接而被掩埋或破壞，導(dǎo)致酶催化性能和穩(wěn)定性大幅降低甚至完全喪失。隨著一步純化與定點(diǎn)固定化理念興起，它通過(guò)一步反應(yīng)從粗酶液中純化和固定化了酶，其在簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟和降低生

2、產(chǎn)成本方面效果明顯，但至今文獻(xiàn)報(bào)道僅10余篇，且需要使用Co2+、Cu2+、Ni2+等重金屬離子，僅限于His-Tag標(biāo)簽法。本論文在非天然氨基酸對(duì)天然酶進(jìn)行定點(diǎn)修飾基礎(chǔ)上，利用其定位作用和連接反應(yīng)的生物正交性，實(shí)現(xiàn)酶蛋白的位點(diǎn)特異性共價(jià)固定研究，并同步實(shí)現(xiàn)酶的純化，讓開(kāi)辟新方法和克服傳統(tǒng)方法中的問(wèn)題成為了可能。
　　 本研究借助PCR技術(shù)將硫酸酯酶活性中心基因序列拼接在脂肪酶的3'端，制備重組質(zhì)粒pET28a-lipa(1)d

3、6，甲酰甘氨酸生成酶(FGE，formylglycine-generating enzyme)基因連接在pBAD/myc-his A載體上;將上述兩個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，熒光實(shí)驗(yàn)證明表達(dá)出的甲酰甘氨酸脂肪酶含有醛基基團(tuán)，甲酰甘氨酸完成了對(duì)脂肪酶的C端修飾，甲酰甘氨酸脂肪酶酶活和酶量與脂肪酶同等。利用甲酰甘氨酸脂肪酶的醛基基團(tuán)與氨基化介孔泡沫硅載體(MCFs-NH2)發(fā)生席夫堿反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了甲酰甘氨酸脂肪酶

4、粗酶液的一步純化與定點(diǎn)固定化。其中固定化甲酰甘氨酸脂肪酶絕對(duì)活力是游離脂肪酶的0.5倍，是1.5mM戊二醛固定化酶的2.5倍，固定化酶的催化效率是戊二醛固定化酶的3.0倍。在50℃、19h后，固定化甲酰甘氨酸脂肪酶仍有原活力的58.7％，是相同條件下1.5mM戊二醛固定化酶酶活的1.5倍，15mM戊二醛固定化酶酶活的1.7倍。由于甲酰甘氨酸修飾的脂肪酶固定僅能發(fā)生在N端或C端，為了進(jìn)一步開(kāi)拓酶的定點(diǎn)固定方法，在此運(yùn)用生物正交方法對(duì)脂肪酶

5、進(jìn)行定點(diǎn)修飾，通過(guò)對(duì)脂肪酶蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用重疊延伸PCR技術(shù)，對(duì)脂肪酶理論非活性位點(diǎn)定點(diǎn)突變?yōu)門(mén)AG，后連接在pET24a(+)載體上，將pACYC184-2MjtRNATyurCUA、pBR322-MjTyrRS10與上述重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化在大腸桿菌BL21(DE3)中，通過(guò)Western Blot和ESI-MS檢測(cè)，證明表達(dá)出了對(duì)疊氮苯丙氨酸脂肪酶，對(duì)疊氮苯丙氨酸完成了對(duì)脂肪酶的定點(diǎn)修飾，AzPhe-lip243酶活最大，其值

6、為213.3U/mg，AzPhe-lip355的蛋白表達(dá)量最大，其值為5.7mg/L。后利用對(duì)疊氮苯丙氨酸脂肪酶的疊氮基團(tuán)與環(huán)辛炔基化介孔泡沫硅載體發(fā)生無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)疊氮苯丙氨酸脂肪酶的定點(diǎn)固定。IM-AzPhe-lip137的酶活達(dá)到175.8U/mg，是AzPhe-lip137游離酶酶活的106.9％。在50℃條件、29h后，IM-AzPhe-lip137的絕對(duì)活力為124.6 U/mg，相對(duì)活力為初始固定化酶活的70.9