DEHP對(duì)大鼠離體海馬神經(jīng)元樹(shù)突和突觸形態(tài)發(fā)育的影響.pdf

1、鄰苯二甲酸（2-乙基己基）酯[di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP]是典型的一類鄰苯二甲酸酯，是應(yīng)用廣泛的一種塑化劑，它極易從塑料產(chǎn)品上釋放出來(lái)污染生態(tài)環(huán)境，從而使人類和野生動(dòng)物暴露其中。大量實(shí)驗(yàn)表明，DEHP是一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，使機(jī)體產(chǎn)生生殖發(fā)育毒性、遺傳毒性和多種器官癌變等損傷，但是目前人們對(duì)其神經(jīng)發(fā)育毒性的認(rèn)識(shí)還很少。性激素對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突發(fā)育和突觸發(fā)生起重要作用，并因此影響腦的發(fā)育和功能。由于DEHP

2、具有抗雄激素和擬雌激素的活性，進(jìn)入機(jī)體后可能會(huì)干擾性激素的正常生理活性，影響個(gè)體的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明，圍生期暴露DEHP會(huì)使小鼠產(chǎn)生學(xué)習(xí)記憶損傷和焦慮抑郁樣的行為，表明DEHP影響動(dòng)物的神經(jīng)行為發(fā)育。鑒于神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)是其活動(dòng)的基礎(chǔ)，我們推測(cè)DEHP可能會(huì)影響神經(jīng)元的發(fā)育。
　　在神經(jīng)元發(fā)育的初期，樹(shù)突干上生長(zhǎng)許多樹(shù)突生長(zhǎng)錐和樹(shù)突絲，之后，樹(shù)突絲逐漸被粗而短，形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定的樹(shù)突棘所取代，而90％以上的興奮性突觸

3、發(fā)生于樹(shù)突棘。成熟穩(wěn)定的樹(shù)突棘是神經(jīng)元間產(chǎn)生突觸聯(lián)系的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。突觸密度大表示神經(jīng)系統(tǒng)的突觸網(wǎng)絡(luò)連接非常復(fù)雜，且可塑性潛力較大。因此，神經(jīng)元的樹(shù)突棘發(fā)育、突觸的建立和神經(jīng)回路的形成就構(gòu)成了腦發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雌激素可與雌激素受體結(jié)合，通過(guò)激活一系列信號(hào)通路或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)樹(shù)突發(fā)育和突觸可塑性。突觸部位關(guān)鍵蛋白的水平變化直接影響突觸間的傳遞效能。突觸素Ⅰ(SynapsinⅠ)是位于突觸前膜的一種標(biāo)志性蛋白，細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(

4、extracellular regulated protein kinases，ERK)途徑被激活后，可以使SynapsinⅠ發(fā)生磷酸化，參與調(diào)控突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。PSD95是神經(jīng)元突觸后致密區(qū)的腳手架蛋白，聯(lián)系和錨定N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)、α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑受體（AMPAR）和下游信號(hào)分子于突觸后膜上，這種結(jié)構(gòu)上的緊密聯(lián)系在突觸可塑性中發(fā)揮著重要作用。DEHP是否會(huì)通過(guò)與雌激素類似的途徑影響樹(shù)突和

5、突觸的發(fā)育，我們不得而知。
　　本實(shí)驗(yàn)研究DEHP長(zhǎng)時(shí)暴露對(duì)離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元樹(shù)突和突觸發(fā)育的影響，利用雌激素受體阻斷劑ICI182，780和Western blot技術(shù)初步探討DEHP長(zhǎng)時(shí)暴露的分子機(jī)制。
　　方法:取新生24 h的健康SD大鼠乳鼠的海馬，體外培養(yǎng)第5天(DIV5)進(jìn)行DEHP暴露5天。首先，設(shè)置對(duì)照組(DMSO)、DEHP組（1、10、100nM，1和10μM），探究DEHP的劑量效應(yīng)。于DIV10對(duì)細(xì)

6、胞進(jìn)行免疫熒光染色，觀察神經(jīng)元樹(shù)突和突觸的形態(tài)。其次，選取效應(yīng)極顯著的劑量（1nM或1μM）進(jìn)一步研究，設(shè)置對(duì)照組、DEHP組、雌二醇(E2)組、DEHP+E2組，探討DEHP與E2之間的關(guān)系;然后，應(yīng)用雌激素受體阻斷劑ICI182，780探究DEHP是否通過(guò)雌激素受體影響神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)育。
　　采用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽特異性標(biāo)記神經(jīng)元纖維型肌動(dòng)蛋白(F-actin)，在激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)樹(shù)突絲和樹(shù)突棘的密度;采用免疫雙熒光染

7、色分別標(biāo)記突觸前蛋白SynapsinⅠ和細(xì)胞骨架F-actin，由SynapsinⅠ（綠色熒光）和F-actin（紅色熒光）共定位突觸（黃色熒光），統(tǒng)計(jì)樹(shù)突上突觸的密度。
　　為了進(jìn)一步探討DEHP影響神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育的分子機(jī)制，采用western blot方法檢測(cè)神經(jīng)元SynapsinⅠ、PSD95和NMDAR亞基NR2B的蛋白水平，分析突觸蛋白和興奮性氨基酸受體亞基的變化;檢測(cè)ERK和p-ERK的蛋白表達(dá)變化，以探究NMDAR和

8、ERK信號(hào)途徑是否參與DEHP長(zhǎng)時(shí)暴露對(duì)神經(jīng)元發(fā)育的影響。
　　結(jié)果:1.DEHP(1 nM～10μM)暴露5天，顯著降低海馬神經(jīng)元的樹(shù)突絲和樹(shù)突棘密度(P＜0.05，P＜0.01)，效應(yīng)曲線呈“U”型，提示DEHP抑制神經(jīng)元樹(shù)突的發(fā)育;與E2組相比，（1nM或1μM）DEHP+E2組顯著抑制樹(shù)突絲和樹(shù)突棘密度(P＜0.01)，提示DEHP與雌激素共同作用表現(xiàn)出拮抗的效應(yīng);DEHP+ICI組和DEHP組相比較，樹(shù)突絲和樹(shù)突棘的密度

9、顯著上調(diào)(P＜0.01)，但是DEHP+ICI組與ICI組存在顯著差異(P＜0.01)，暗示雌激素受體阻斷劑部分消除DEHP的抑制作用，推測(cè)雌激素受體參與DEHP對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突發(fā)育的抑制效應(yīng)。
　　2.(1 nM～10μM)DEHP暴露5天顯著降低海馬神經(jīng)元突觸密度(P＜0.01)，10 nM DEHP對(duì)突觸密度的影響無(wú)顯著差異，效應(yīng)曲線呈“U”型，提示DEHP抑制神經(jīng)元突觸的發(fā)育;（1nM或1μM）DEHP顯著抑制E2對(duì)樹(shù)突絲和樹(shù)

10、突棘密度的促進(jìn)作用(P＜0.01)，提示DEHP與雌激素共同作用時(shí)表現(xiàn)出拮抗效應(yīng);DEHP+ICI組和DEHP組相比，突觸的密度顯著上調(diào)(P＜0.01)，而DEHP+ICI組與ICI組仍差異顯著(P＜0.01)，提示雌激素受體阻斷劑可以部分解除DEHP的抑制效應(yīng)，推測(cè)雌激素受體可能參與其對(duì)突觸發(fā)育的不利作用。
　　3.Western blot分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEHP（1nM和1μM）長(zhǎng)時(shí)暴露5天顯著下調(diào)NMDAR亞基NR2B（P＜0

11、.05或P＜0.01）及突觸蛋白SynapsinⅠ(P＜0.01或P＜0.01)和PSD95（P＜0.01或P＜0.01）的表達(dá)水平，顯著降低p-ERK的活性（P＜0.01或P＜0.01）。
　　結(jié)論:DEHP長(zhǎng)時(shí)暴露顯著下調(diào)體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元樹(shù)突絲、樹(shù)突棘和突觸密度;同時(shí)降低突觸蛋白SynapsinⅠ和PSD95的表達(dá)水平，使NMDAR亞基NR2B表達(dá)下調(diào)，p-ERK的活性降低，提示DEHP長(zhǎng)時(shí)暴露抑制海馬神經(jīng)元的樹(shù)突和突