PI3K-Akt信號(hào)通路在錳致PC12細(xì)胞毒性中的作用研究.pdf

1、目的:通過體外PC12細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討錳染毒對(duì)神經(jīng)細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響及該信號(hào)通路在錳致神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡過程中的作用。
　　方法:采用0，25，75，125μM硫酸錳(MnSO4)分別對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行染毒24小時(shí)后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)用CCK8法測定其存活率，AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒檢測其凋亡率，南京建成試劑盒檢測其SOD、GSH-Px、CAT及MDA水平，Western Blo

2、t法測定其PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白Akt、FoxO3的相對(duì)表達(dá)量表達(dá)及其磷酸化水平，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法測定其Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。此外，采用濃度為50μM的PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002提前處理PC12細(xì)胞1小時(shí)后MnSO4染毒，染錳劑量、時(shí)間、檢測指標(biāo)同上述染毒實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　(1)隨著染錳劑量的增加，PC12細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT活力降

3、低，MDA含量升高。高劑量組SOD、GSH-Px活力分別為（219.308±6.602）U/ml、（189.383±17.824）U均顯著低于對(duì)照組、低劑量組及中劑量組。中、高劑量組CAT活力（10.832±1.395）U/ml、（9.202±1.046）U/ml均顯著低于對(duì)照組與低劑量組。高劑量組MDA含量為（11.912±2.734）nmol/L，顯著高于對(duì)照組及低、中、高劑量組。
　　(2)隨著染錳劑量的增加，PC12細(xì)胞P

4、I3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)磷酸化蛋白表達(dá)水平顯著增加。各染錳組p-Akt、p-FoxO3蛋白表達(dá)水平及p-Akt/Akt、p-FoxO3/FoxO3比率均顯著高于對(duì)照組。
　　(3)隨著染錳濃度的增加，PC12細(xì)胞凋亡率增加;各組間凋亡率有顯著性差異，對(duì)照、低、中、高劑量組凋亡率分別為（-0.002±8.049）、（7.093±2.905）、（17.614±2.678）、（34.529±1.739）。Bax基因mRNA表達(dá)水平呈增

5、高趨勢(shì);Bcl-2、Caspase-3基因mRNA表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)。中、高劑量組Bcl-2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（0.776±0.031）、（0.418±0.030）均顯著低于低劑量組（0.984±0.034）及對(duì)照組。高劑量組Bax基因mRNA相對(duì)表達(dá)量為(2.496±0.281)顯著高于對(duì)照組、低劑量組（1.103±0.027）及中劑量組（1.327±0.043）。低、中、高劑量組Caspase-3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量分別

6、為（0.897±0.038）、（0.547±0.035）、（0.473±0.008），均顯著低于對(duì)照組。細(xì)胞形態(tài)也隨著染錳濃度的增加發(fā)生不同程度的改變。
　　(4) p-Akt蛋白、p-FoxO3蛋白相對(duì)表達(dá)量與氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、GSH-Px、CAT、MDA均有顯著相關(guān)性。其中，p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量與SOD、GSH-Px、CAT呈負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為-0.774，-0.947，-0.802;與MDA呈正相關(guān)性。p-Fox

7、O3蛋白相對(duì)表達(dá)量與SOD、GSH-Px、CAT呈負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為-0.766，-0.946，-0.826;與MDA呈正相關(guān)性。
　　(5)p-Akt蛋白、p-FoxO3蛋白相對(duì)表達(dá)量與凋亡指標(biāo)Bcl-2、Caspase-3、Bax均有相關(guān)性。其中，p-Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量與Bcl-2、Caspase-3呈負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為-0.819，-0.969;與Bax呈正相關(guān)性。p-FoxO3蛋白相對(duì)表達(dá)量與Bcl-2、Ca

8、spase-3呈負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為-0.831，-0.879;與Bax呈正相關(guān)性。
　　(6) PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑+錳染毒組與僅有錳染毒組相比，隨著染錳濃度的增加，PC12細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT活力呈降低趨勢(shì)且比錳染毒組更低，MDA含量呈增高趨勢(shì)且比錳染毒組更高;PC12細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì)，且各抑制劑+錳染毒組的凋亡率均高于錳染毒組;抑制劑+錳染毒組Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著均低于各錳染毒組