基于微流控技術(shù)的感染性病原體基因診斷研究.pdf

1、廣州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文基于微流控技術(shù)的感染性病原體基因診斷研究姓名：王秋平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：周小棉2011-05廣州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 基于微流控技術(shù)的感染性病原體基因診斷研究 2成本效益低。因此，該方法有潛力應(yīng)用于乙型肝炎患者接受拉米夫定治療的 YMDD突變檢測(cè)。 22. 基于毛細(xì)管直接 基于毛細(xì)管直接 PCR 的新德里金屬 的新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶 內(nèi)酰胺酶-1

2、耐藥基因快速和靈敏檢測(cè)耐藥基因快速和靈敏檢測(cè) 目的： 目的： 利用毛細(xì)管直接 PCR 發(fā)展一種用于新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1 （New Delthi Metallo-bata -Lactamase，NDM-1）耐藥基因快速和靈敏檢測(cè)的方法。 方法 方法： 采用改良型高性能的 DNA 聚合酶， 發(fā)展一種液體振蕩流毛細(xì)管直接 PCR，結(jié)合芯片電泳檢測(cè)實(shí)現(xiàn) NDM-1 基因陽(yáng)性菌的快速鑒定?？疾煸摲椒ㄟM(jìn)行 NDM-1 基因擴(kuò)增的酶濃度、標(biāo)本

3、用量，以及擴(kuò)增的退火溫度和延伸時(shí)間。通過輸入標(biāo)準(zhǔn)樣品考察上述方法的靈敏度和特異性。 利用毛細(xì)管直接 PCR 和常規(guī) PCR 法對(duì)臨床微生物檢測(cè)的 70 株腸道桿菌和 55 株鮑曼不動(dòng)桿菌（亞胺培南 MIC≧64 µg/ml）的 NDM-1基因進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。 結(jié)果： 結(jié)果：在優(yōu)化的分析條件下，相比常規(guī) PCR，毛細(xì)管直接 PCR 反應(yīng)所需試劑用量更少（只需 3 µL） ，完成 DNA 擴(kuò)增時(shí)間更短

4、（只需 16 min） 。毛細(xì)管直接 PCR 效果隨著酶濃度的增加而提高，當(dāng)酶加入量為 0.5 µL 時(shí)趨向于飽和；最合適檢測(cè)標(biāo)本體積為 2 µL； 每個(gè)循環(huán)中在 68 ℃溫區(qū)暫停 10 s，將退火和延伸時(shí)間加長(zhǎng)，芯片電泳熒光信號(hào)達(dá)最大值。結(jié)合芯片電泳檢測(cè)，該方法檢測(cè)最低限為 1.15×102 CFU /mL。125 例臨床樣本中，兩種方法檢測(cè)出 2 例 NDM-1 基因陽(yáng)性。2 例陽(yáng)性標(biāo)本基因擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)

5、序結(jié)果與 Genbank 比對(duì)符合率為 100%。 結(jié)論 結(jié)論 毛細(xì)管直接 PCR 聯(lián)合芯片電泳方法能實(shí)現(xiàn) NDM-1 耐藥基因的快速擴(kuò)增和檢測(cè)。該方法具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、特異性強(qiáng)，高靈敏等特點(diǎn)，適合于臨床 NDM-1 基因（+）耐藥菌的早期快速檢測(cè)。 關(guān)鍵詞 關(guān)鍵詞：芯片電泳；毛細(xì)管 PCR；乙型肝炎病毒；拉米夫定耐藥變異；新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1（ New Delthi Metallo-bata –Lactam