水稻基腐病菌hfq和crp基因的功能研究.pdf

1、玉米狄克氏菌（Dickeyazeae，簡(jiǎn)稱(chēng)D.zeae，異名：Erwinia chrysanthemi pv.zeae）是一種世界性重要植物病原細(xì)菌，寄主范圍廣泛。由它引起的水稻細(xì)菌性基腐病是水稻上重要細(xì)菌病害之一，在我國(guó)及東南亞國(guó)家的局部稻區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，導(dǎo)致水稻嚴(yán)重減產(chǎn)。目前對(duì)病原菌D.zeae的致病性及其致病性調(diào)控機(jī)理研究還不完善，hfq和crp分別編碼sRNA分子伴侶 Hfq和環(huán)腺苷單磷酸受體蛋白（CRP），它們?cè)谒净【械淖?/p>

2、用，尚不清楚。
　　為了明確hfq和crp在D.zeae中的致病作用，本論文以水稻基腐病菌DZJS-4為材料，通過(guò)無(wú)痕基因敲除的方法，構(gòu)建獲得了DZJS-4的hfq和crp基因缺失突變體△hfq和△crp。表型測(cè)定結(jié)果表明，與野生型相比突變體△hfq和△crp的生長(zhǎng)速率明顯下降、形成生物膜的能力減弱，纖維素酶和果膠酶的活性降低，在大白菜上的軟腐癥狀減弱，都失去了在寄主植物水稻上的致病力；其中，突變體△hfq的胞外蛋白酶和毒素的活性

3、均完全喪失，煙草上的HR能力減弱，顯著影響水稻種子萌發(fā)的抑制作用，且在不同環(huán)境壓力（低溫、高溫、10％乙醇、10%蔗糖、20%蔗糖）下的生存能力也明顯減弱；而突變體△crp產(chǎn)生胞外蛋白酶和毒素的能力下降，對(duì)水稻種子萌發(fā)和煙草HR影響較小。進(jìn)一步功能互補(bǔ)分析結(jié)果表明，突變體△hfq和△crp的互補(bǔ)體表型特征均能恢復(fù)成野生型。
　　為了更進(jìn)一步了解hfq對(duì)上下游基因的調(diào)控關(guān)系，本論文采用Illumina HiSeq200的測(cè)序平臺(tái)對(duì)水

4、稻基腐菌DZJS-4和突變體△hfq菌株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，并比較它們之間基因轉(zhuǎn)錄水平的差異，測(cè)序結(jié)果顯示，與野生型相比，△hfq中共有3537個(gè)基因轉(zhuǎn)錄豐度發(fā)生了改變，其中（|log2(FoldChange)|>1且qvalue<0.005）的差異基因有710個(gè)，347個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，363個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制。同時(shí)，對(duì)其差異基因進(jìn)行了GO富集分析和KEGG富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些差異基因涉及細(xì)菌的鞭毛組成（Flagellar ass

5、embly），雙組分系統(tǒng)（Two-component system），脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism），細(xì)菌趨化性（Bacterial chemotaxis），ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC transporters），細(xì)菌的分泌系統(tǒng)（Bacterial secretion system）等途徑。突變體△hfq中有22個(gè)T6SS基因及30個(gè)鞭毛系統(tǒng)基因的表達(dá)受到hfq的調(diào)控，趨化性基因簇中的32個(gè)基因也表出不同的轉(zhuǎn)錄水平

6、差異。此外，野生菌DZJS-4和突變體△hfq之間有43個(gè)sRNA的表達(dá)存在顯著差異。對(duì)候選sRNA靶標(biāo)基因分析表明，每個(gè)候選sRNA都對(duì)應(yīng)著多個(gè)靶標(biāo)基因。選擇部分差異表達(dá)基因和候選sRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基本吻合，Hfq正向調(diào)控hcp、vgrG、vasJ、vasD、impB、impC、zmsA、pelE、celZ、cytB、prtC及細(xì)菌代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，負(fù)調(diào)控鞭毛基因簇、yliB、ycgG、vfmE