芽孢桿菌角蛋白降解菌及其胞外角蛋白酶的性質(zhì)、應(yīng)用研究.pdf

1、微生物角蛋白酶底物廣泛，既能降解可溶性蛋白，又能降解不可溶蛋白，因此在清潔劑、制革業(yè)、紡織業(yè)、飼料添加劑等行業(yè)，角蛋白酶能更好地替代傳統(tǒng)蛋白酶;由于角蛋白酶能降解普通蛋白酶難以降解的富含角蛋白的羽毛、羊毛、蹄甲、毛發(fā)，因此被廣泛應(yīng)用于制革業(yè)、紡織業(yè)和角蛋白廢棄物的處理。
　　直至目前，篩選、發(fā)掘、研究有角蛋白酶生產(chǎn)能力的微生物菌株，以及繼續(xù)開發(fā)這些菌株產(chǎn)的有潛在工業(yè)、商業(yè)應(yīng)用潛力的角蛋白酶資源，仍是角蛋白酶研究中的重要的、待解決的

2、問題。
　　本實(shí)驗(yàn)室保存有多株角蛋白酶高產(chǎn)菌株，本研究選擇其中有代表性的3株進(jìn)行研究。
　　1、枯草芽孢桿菌Y3-4(Bacillus subtilis Y3-4)既能很好地降解羊毛（α-角蛋白），也能很好地降解羽毛（β-角蛋白），為更好地研究其角蛋白酶性質(zhì)，我們對該菌胞外發(fā)酵液進(jìn)行部分純化，研究了粗酶液的最適酶活溫度等基本酶學(xué)性質(zhì)，以及還原劑、去垢劑等對該酶的影響，并對角蛋白酶在降解角蛋白廢棄物等方面的應(yīng)用能力進(jìn)行了評價(jià)。

3、
　　2、枯草芽孢桿菌FJ-3-16(Bacillus subtilis FJ-3-16)產(chǎn)的主要角蛋白酶KerFJ比活高、抗逆性好、在角蛋白廢棄物降解、洗滌劑添加劑和酶法脫毛方面具有很好的應(yīng)用潛力。本論文通過單因子實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法(Response surface method，RSM)優(yōu)化了B.subtilis FJ-3-16的產(chǎn)酶條件，并建立了50L發(fā)酵罐的產(chǎn)酶工藝，同時(shí)研究了該菌發(fā)

4、酵液對難脫毛生豬（巴馬香豬）豬皮及豬蹄的脫毛效果。在優(yōu)化原始菌株產(chǎn)酶條件的基礎(chǔ)上，本論文還對該菌產(chǎn)的角蛋白酶KerFJ在畢赤酵母中的異源表達(dá)進(jìn)行了研究。
　　3、蠟樣芽孢桿菌Y-15(Bacillus cereus Y-15)是本實(shí)驗(yàn)室在某食品廠長期浸沒羽毛的排污管淤泥中分離得到的一株菌，具有很好的羽毛降解能力。本論文利用目視觀察和電鏡觀察了降解過程中羽毛底物結(jié)構(gòu)的破壞，并利用RSM方法優(yōu)化其產(chǎn)酶條件，為該菌株進(jìn)一步的應(yīng)用奠定了基

5、礎(chǔ)。
　　本論文研究結(jié)果如下:
　　1、B.subtilis Y3-4胞外部分純化獲得的角蛋白酶催化角蛋白水解的最適反應(yīng)溫度和pH分別為55℃和pH8.0，說明該酶屬于中溫堿性蛋白酶;該酶在pH6.0～10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性很好，溫度超過50℃時(shí)酶活喪失很快。PMSF能夠抑制其90％酶活，而專一性Zn螯合劑性鄰菲羅啉(1，10-Phenanthrolinemonohydrate，O-P)對其酶活幾乎無影響，這些抑制劑實(shí)驗(yàn)表明該

6、酶屬于絲氨酸蛋白酶。金屬離子螯合劑EDTA、EGTA抑制80％-90％角蛋白酶活性，金屬離子實(shí)驗(yàn)表明Cu2+、K2+、Ca2+能提高Y3-4酶液的酶活，而Ni2+和Co2+對其有明顯抑制作用。該酶耐受氧化劑H2O2、NaClO、Sodium cholate能力弱，在還原劑DTT、β-ME和DTNB存在時(shí)酶活有所提高或基本不變，說明該酶具有一定的抗逆性。該酶在大部分洗衣液中穩(wěn)定性良好，并且作為洗滌劑添加劑具有很好的去污效果。此外，該酶還能

7、夠?qū)ρ蚱っ撁哂忻阜撁膽?yīng)用潛力。
　　2、優(yōu)化后的B.subtilis FJ-3-16培養(yǎng)基配方為:豆粉3.62％、酪素2％、玉米粉1.41％、CaCl20.16％、KH2PO40.1％、K2HPO40.3％，在37℃,250r/min條件下培養(yǎng)48h獲得最大酶活，酶活由原有的73.82U/mL提高至166.08U/mL，提高了1.25倍。本論文建立了50L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶工藝，酶活進(jìn)一步由166.08U/mL提高到207.6

8、U/mL，提高了0.44倍，同時(shí)產(chǎn)酶時(shí)間由48h縮短至18h。B.subtilisF J-3-16粗酶液對巴馬香豬小塊皮張的脫毛以及對整蹄具有優(yōu)異的脫毛效果:6h完成小塊皮張的脫毛，10h可完成整蹄脫毛，20L發(fā)酵液可一次性處理巴馬香豬豬蹄/豬皮/豬頭約40kg，脫毛后的皮張品相完整、賣相佳。本論文揭示B.subtilis FJ-3-16在巴馬香豬為代表的難脫毛生豬的脫毛中具有極好的應(yīng)用前景，為實(shí)現(xiàn)角蛋白酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。<

9、br>　　本實(shí)驗(yàn)室對B.subtilisF J-3-16基因組進(jìn)行測序，獲得了角蛋白酶kerFJ基因序列。本研究克隆得到該基因，成功構(gòu)建重組載體pPICZαA-kerFJ，并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，驗(yàn)證得到8株重組菌株。
　　3、B.cereus Y-15可在以羽毛為唯一碳氮源的培養(yǎng)基中迅速生長，48h時(shí)羽毛降解率為47.5％，培養(yǎng)至120h降解率達(dá)90.7％，說明該菌能高效降解羽毛廢棄物。目視觀察和電鏡觀察表明降解過程中羽毛的羽