用主蛋白-1特異性多抗檢測蜂王漿新鮮度和摻假蜂蜜的ELISA技術(shù)研究.pdf

1、蜂王漿是由工蜂由頭部營養(yǎng)腺（包括腦后腺、咽下腺和上分，具有多種生理活性和營養(yǎng)保健功能，主蛋白1(MRJP1)是含量最高的蛋白質(zhì)組分，是蜂王漿的關(guān)鍵功能組分。蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)。據(jù)以往研究報(bào)道，蜂蜜中含有蜜蜂自身分泌的MRJP1蛋白。本文通過研究，建立了采用MRJP1特異性抗體檢測蜂王漿和蜂蜜中的MRJ顎腺等）分泌的乳狀物質(zhì)，它含有豐富的生物活性成P1含量的ELISA檢測新

2、方法，并通過對蜂王漿和蜂蜜中的MRJP1含量分析，進(jìn)行了產(chǎn)品質(zhì)量鑒別。主要結(jié)果如下：
　　(1)建立雙抗體夾心法ELISA檢測MRJP1含量的新方法
　　在原有MRJP1特異性多克隆抗體SP-1的基礎(chǔ)上，采用根據(jù)MRJP1蛋白序列新設(shè)計(jì)的MRJP1特異性多肽，制備了新的特異性多克隆抗體SP-2，對SP-2添加了辣根過氧化酶標(biāo)記(HRP-SP-2)。然后，以SP-1為捕獲抗體，以酶標(biāo)抗體HRP-SP-2為檢測抗體，建立了雙抗體

3、夾心ELISA檢測方法。經(jīng)對雙抗體夾心每步反應(yīng)作條件優(yōu)化，得到最佳反應(yīng)條件:包被捕獲抗體，37℃反應(yīng)2h;5％脫脂奶粉，4℃封閉過夜;加入抗原，4℃反應(yīng)過夜;加入酶標(biāo)抗體，37℃反應(yīng)2 h;加入TMB顯色液，37℃反應(yīng)15 min。
　　(2)間接法和夾心法ELISA檢測方法優(yōu)勢比較
　　采用間接法和夾心法ELISA分別進(jìn)行了MRJP1含量比較，包括:檢測范圍、重復(fù)性、精確度。結(jié)果表明:間接法檢測范圍為1-5.5μg/mL，

4、樣品回收率在77.96％-178.97％，變異系數(shù)在2.22％-19.39％;雙抗體夾心法檢測范圍在2.5-10μg/mL，樣品回收率在92.74％-100.72％，變異系數(shù)2.75％-12.4％。表明，相對于間接法ELISA，夾心法具有準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，能滿足快速檢測條件的優(yōu)點(diǎn)。
　　(3)雙抗體夾心法ELISA檢測蜂王漿新鮮度
　　建立了用雙抗體夾心ELISA檢測蜂王漿新鮮度的方法。將新鮮蜂王漿置于40℃下放置0、7、

5、14、21、28、35 d后，然后雙抗體夾心ELISA法分別檢測不同處理時(shí)間樣品的MRJP1降解程度，并與間接法法ELISA和SDS-PAGE電泳結(jié)果作對比驗(yàn)證。結(jié)果顯示，鮮王漿中MRJP1在40℃下儲存后明顯降解，且與保溫時(shí)間成正相關(guān)。
　　(4)蜂蜜中MRJP1含量的SDS-PAGE電泳檢測
　　對蜂蜜樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)，用ImageJ軟件分析MRJP1電泳條帶灰度，以一定濃度的MRJP1標(biāo)準(zhǔn)品為指示蛋白，

6、估算蜂蜜中MRJP1含量。在洋槐蜜中按比例加入玉米糖漿，分析SDS-PAGE電泳條帶灰度，電泳條帶灰度比與理論值接近，結(jié)果表明用SDS-PAGE電泳分析鑒定已知蜜的真?zhèn)尉哂锌尚行浴７治隽?0個未知蜜源的商品蜂蜜樣品，根據(jù)電泳條帶預(yù)判真?zhèn)?，顯示5個樣品為真蜂蜜、2個屬摻假蜂蜜、3個屬可能摻假蜂蜜。
　　(5)蜂蜜中MRJP1含量的ELISA檢測
　　分別對6種已知蜜進(jìn)行間接法和夾心法ELISA分析，同時(shí)對蜂蜜進(jìn)行脫色處理，驗(yàn)證

7、蜂蜜顏色對結(jié)果的影響，結(jié)果表明淺色蜜用間接ELISA法可不經(jīng)脫色處理，深色蜜用間接ELISA法需經(jīng)脫色處理，采用雙抗體夾心法可省略脫色過程，結(jié)果較準(zhǔn)確。
　　(6)摻假蜂蜜和商品蜂蜜真?zhèn)蔚腅LISA檢測
　　在洋槐蜜中按比例摻入玉米糖漿，再用雙抗體夾心ELISA法檢測摻假洋槐蜜中的MRJP1含量。結(jié)果表明，洋槐蜜中玉米糖漿含量與MRJP1含量成負(fù)相關(guān)，證實(shí)ELISA法鑒別摻假蜂蜜可行。在此基礎(chǔ)上，對來自澳門市場的10個未知蜂