煙草花粉管內(nèi)吞作用機制的細胞學和蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、真核細胞中,內(nèi)膜系統(tǒng)和分泌機制高度統(tǒng)一,密切配合。它們對細胞內(nèi)外各種大分子物質(zhì)的運輸以及對質(zhì)膜,液泡膜等的構成都起到關鍵性作用,這個過程相當復雜,包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng),高爾基體,各種分泌囊泡的系統(tǒng)作用以及一些起到媒介作用的細胞器,例如液泡前體等。其中,內(nèi)吞作用是膜成分主要運輸機制,它在花粉管和根尖這些生長旺盛的部位極其活躍,并和這些細胞的生長機制聯(lián)系緊密。
　　 本文以煙草花粉為實驗材料,使用Brefeldin A(BFA)和Ikagur

2、amycin(IKA)這兩種不同作用機理的抑制劑對生長中的花粉管進行處理,利用蛋白質(zhì)組學技術獲得差異表達的蛋白質(zhì)圖譜,并進行質(zhì)譜分析。同時利用電子顯微鏡技術觀察細胞亞細胞結構的形態(tài)變化,以探究煙草花粉管的內(nèi)吞作用和生長機制。主要研究結果如下:
　　 1.獲得了經(jīng)抑制劑處理的差異表達的煙草花粉管蛋白圖譜
　　 兩種抑制劑具有不同的作用機制,它們或通過干擾細胞骨架結構或抑制內(nèi)吞作用中的參與蛋白的合成裝配,從而干擾植物細胞內(nèi)吞

3、作用。我們通過雙向電泳技術,獲得差異表達的蛋白質(zhì),并對差異顯著點進行了MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定,發(fā)現(xiàn)其中28個點的表達豐度在對照試驗和經(jīng)抑制劑處理過的花粉管間差異較為顯著。鑒定出21種蛋白質(zhì),其中13個表達豐度上升,主要包括花粉管壁的修飾(果膠甲酯酶,高爾基體結合蛋白)、肌動蛋白細胞骨架組織(肌動蛋白)、能量代謝(ATP酶亞基1、異檸檬酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、焦磷酸酶、葡萄糖-1-磷酸酯尿甙基轉(zhuǎn)移酶等)、信號轉(zhuǎn)導(Rab GD

4、P解離抑制因子、腺苷激酶)、蛋白質(zhì)的折疊與加工(線粒體加工肽酶、蛋白質(zhì)二硫化物異構酶)等；8個蛋白質(zhì)的表達豐度下降,主要包括一些花粉致敏原和一些參與脅迫反應的蛋白質(zhì)(過氧化物酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等)。
　　 2.利用電子顯微鏡技術研究了亞細胞結構的變化
　　 我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過兩種抑制劑處理的花粉管液泡明顯減少,而在花粉管頂端出現(xiàn)大量小而多的分泌囊泡,在最頂端的區(qū)域能觀察到較大的細胞器,例如線粒體和脂肪粒。通抑制

5、劑處理后,有的高爾基體的堆疊發(fā)生一定彌散,還有一部分高爾基體趨向其反相發(fā)生彎曲,同時周圍的分泌囊泡數(shù)量減少。我們還觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生膨脹,一部分核糖體從從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離。但是并沒有發(fā)現(xiàn)線粒體在對照以及處理中發(fā)生顯著地差異。
　　 本文運用雙向電泳結合串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測了煙草花粉萌發(fā)及花粉管生長中蛋白質(zhì)組的變化,鑒定了萌發(fā)前后差異表達的蛋白質(zhì),并分析了煙草花粉萌發(fā)過程中表達豐度變化蛋白質(zhì)的功能類群特征,為進一步揭示煙草花粉內(nèi)吞作用