放線菌和矮牽牛BAC文庫的構(gòu)建及相關(guān)基因的篩選.pdf

1、細(xì)菌人工染色體文庫是生物基因組研究的重要資源，它們被成功地應(yīng)用于圖位克隆，構(gòu)建物理圖譜以及全基因組測序。本研究工作由兩部分組成:1.放線菌BAC載體改造及放線菌0026BAC文庫構(gòu)建;2.矮牽牛BAC文庫構(gòu)建及相關(guān)基因篩選。
　　放線菌(Actinomycetes)產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥和學(xué)術(shù)研究上有著重要意義。常用于構(gòu)建放線菌BAC（Bacterial artificial chromosome）文庫的載體為pMSBBACs，

2、用其構(gòu)建的放線菌BAC文庫在進(jìn)行質(zhì)量檢測時(shí)存在一定的缺陷。本研究通過在放線菌復(fù)合載體pMSBBACs中引入歸位內(nèi)切酶Ⅰ-SceI位點(diǎn)，改造出適用于放線菌屬大片段基因組DNA克隆和異源表達(dá)的pHZAUBACFXJ復(fù)合載體。pHZAUBACFXJ1載體不僅在構(gòu)建放線菌文庫方面簡單實(shí)用，在驗(yàn)證文庫質(zhì)量時(shí)用Ⅰ-SceI代替NotI進(jìn)行酶切，也方便放線菌BAC文庫外源插入片段大小的計(jì)算，評(píng)估放線菌BAC文庫質(zhì)量。本研究使用pHZAUBACFXJ1

3、復(fù)合載體成功構(gòu)建了一個(gè)放線菌0026的BAC文庫。該文庫總計(jì)3，456個(gè)克隆，保存在9塊384板中，隨機(jī)挑揀40個(gè)放線菌BAC克隆用Ⅰ-SceI酶切檢測，平均插入片段約130kb，空載率約10％。以放線菌0026基因組8Mbp計(jì)算，約覆蓋放線菌0026基因組40倍。構(gòu)建了該BAC文庫行列混合池，并提取行列混合池DNA。合作者已成功利用該文庫篩選到克隆。
　　矮牽牛(Petunia hybrida)因其花期長、花開繁盛等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)

4、用于街邊花壇布置和園林景觀擺設(shè)，在研究植物花發(fā)育中具有重要意義。為了研究矮牽牛開重瓣花的基因調(diào)控序列，本研究利用pHZAUB AC1復(fù)合載體構(gòu)建了一個(gè)含有78，336個(gè)重組克隆的矮牽牛重瓣花BAC文庫，保存在204塊384板中。隨機(jī)挑選440個(gè)矮牽牛BAC克隆檢測外源DNA插入片段大小，平均外源插入片段約為120kb，空載率小于2％。以矮牽牛基因組900Mbp計(jì)算，約覆蓋整個(gè)矮牽牛基因組10倍。通過構(gòu)建高效二維混合池PCR篩選方法，利用