大鼠睪丸酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及與JUNO相互作用蛋白的初步篩選.pdf

1、受精作用因單倍體精子和卵子融合創(chuàng)造出新的基因不同的二倍體有機(jī)體而對(duì)物種的延續(xù)和發(fā)展有著重要的意義。精卵融合是完成受精作用的關(guān)鍵，是由多分子參與的復(fù)雜過(guò)程，但目前為止還尚不明確其分子機(jī)制。研究精卵融合過(guò)程中的蛋白間相互作用，對(duì)了解并解決其中存在的問(wèn)題有著不可估量的價(jià)值。IZUMO1-JUNO間相互作用是精卵融合過(guò)程中最為關(guān)鍵的蛋白相互作用，缺少其中任何一個(gè)都無(wú)法正常的受精。因此本實(shí)驗(yàn)選擇JUNO蛋白作為研究對(duì)象，篩選除IZUMO1外與其相

2、互作用的蛋白。
　　1、大鼠睪丸酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用SMARTTM cDNA合成技術(shù)構(gòu)建了大鼠睪丸的酵母雙雜交文庫(kù)。構(gòu)建的文庫(kù)庫(kù)容為1.5×106 cfu，滴度為8×107 cfu/mL，重組率為78％，插入片段平均長(zhǎng)度為0.7 kb，有較高的進(jìn)行蛋白相互作用篩選的價(jià)值。
　　2、pGBKT7-juno誘餌載體的構(gòu)建
　　以實(shí)驗(yàn)室克隆并保存的pMD19T-juno為模板，去掉信號(hào)肽擴(kuò)增

3、后連接到pGBKT7載體上，并對(duì)其進(jìn)行鑒定、自激活檢測(cè)和細(xì)胞毒性檢測(cè)。通過(guò)利用載體上c-Myc抗原標(biāo)簽，western blot檢測(cè)了pGBKT7-juno誘餌載體在酵母細(xì)胞中表達(dá)情況。使用生物信息學(xué)分析常見(jiàn)哺乳動(dòng)物的JUNO氨基酸序列，繪制了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，分析了在進(jìn)化過(guò)程中的親緣關(guān)系。
　　3、酵母雙雜交篩選與JUNO相互作用蛋白
　　使用構(gòu)建好的大鼠睪丸酵母雙雜交cDNA文庫(kù)和pGBKT7-juno誘餌載體進(jìn)行雜交。共篩選