CXCR4信號(hào)通路在干細(xì)胞介導(dǎo)的心血管修復(fù)中的作用機(jī)制的研究.pdf

1、缺血性心臟病及繼發(fā)的心功能衰竭仍是全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。對(duì)于這類(lèi)疾病傳統(tǒng)的治療方法例如血管成形術(shù)，支架及溶栓藥物治療雖可減輕導(dǎo)致缺血的原因但不能對(duì)缺血后的心肌損傷進(jìn)行再修復(fù)。目前尚沒(méi)有治療藥物或手術(shù)方式能使具有收縮功能的心肌組織替換缺血后的心臟疤痕。最近出現(xiàn)的細(xì)胞治療技術(shù)利用最新鑒定出的祖細(xì)胞群,介導(dǎo)血管及心肌的再生,為缺血性心臟病的治療帶來(lái)了新的前景。但是早期大規(guī)模臨床調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，不論是直接注射祖細(xì)胞到缺血部位還是用藥物

2、動(dòng)員骨髓祖細(xì)胞到循環(huán)中的細(xì)胞治療方法，臨床治療功效不顯著。研究發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)被移植的或被動(dòng)員(到循環(huán)中)的祖細(xì)胞能駐留在缺血部位，缺血部位的祖細(xì)胞駐留不足是細(xì)胞治療功效不高的主要障礙。而且，目前的細(xì)胞動(dòng)員藥物并非特異性動(dòng)員祖細(xì)胞，部分炎癥細(xì)胞也同時(shí)被動(dòng)員到缺血組織，使缺血損傷部位的微環(huán)境惡化，從而破壞祖細(xì)胞的再生能力。因此，加強(qiáng)移植的祖細(xì)胞在缺血部位的招募和停留以及選擇性動(dòng)員內(nèi)源性骨髓祖細(xì)胞方法的研究對(duì)于加強(qiáng)祖細(xì)胞再生能力從而提高細(xì)胞治療

3、的功效具有重要意義。
　　 CXC 趨化因子受體-4 （CXCR4）是G蛋白偶聯(lián)的受體超家族成員之一。CXCR4參與了發(fā)育過(guò)程中的心臟和血管器官發(fā)生，造血細(xì)胞的生成，及免疫應(yīng)答等生物活動(dòng)。最近研究表明CXCR4與其配體基質(zhì)細(xì)胞趨化因子（SDF-1）的相互作用對(duì)于調(diào)節(jié)缺血介導(dǎo)的骨髓祖細(xì)胞的招募以及在骨髓微環(huán)境中維持骨髓祖細(xì)胞的穩(wěn)定起重要作用。本課題研究了CXCR4信號(hào)通路在維持和動(dòng)員骨髓祖細(xì)胞中的分子機(jī)制（第一部分）及CXCR4表

4、達(dá)增多對(duì)于心肌來(lái)源的祖細(xì)胞在缺血的心臟的招募和駐留的調(diào)節(jié)（第二部分）。結(jié)果表明,以CXCR4信號(hào)通路為靶點(diǎn)的細(xì)胞治療能加強(qiáng)祖細(xì)胞介導(dǎo)的心血管修復(fù)。
　　 第一部分CXCR4信號(hào)通路在維持和動(dòng)員骨髓祖細(xì)胞中的分子機(jī)制
　　 目的：在骨髓微環(huán)境中，基質(zhì)細(xì)胞趨化因子（SDF-1）及其受體CXC 趨化因子受體-4（CXCR4）的相互作用對(duì)于調(diào)節(jié)骨髓祖細(xì)胞 (bone marrow progenitor cell)的動(dòng)員起重要作用

5、。缺血損傷能破壞SDF-1和CXCR4 之間的相互作用，釋放骨髓祖細(xì)胞到外周循環(huán)，把循環(huán)中的祖細(xì)胞招募到缺血組織從而促進(jìn)血管再生。藥物性CXCR4 阻斷劑AMD3100也能顯著動(dòng)員骨髓祖細(xì)胞到外周血。但是SDF-1/ CXCR4信號(hào)通路的其他傳導(dǎo)途徑目前還不清楚。C-kit是一個(gè)細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶，干細(xì)胞因子（SCF）的受體，研究發(fā)現(xiàn)c-kit對(duì)骨髓祖細(xì)胞的動(dòng)員和對(duì)缺血組織中的修復(fù)中也起著重要作用。因此本實(shí)驗(yàn)研究SDF-1/ CXCR

6、4信號(hào)通路與c-kit 激酶活性之間的功能關(guān)系。
　　 方法與結(jié)果：干細(xì)胞克隆形成分析試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AMD3100既不能動(dòng)員c-kit基因敲除小鼠的骨髓祖細(xì)胞也不能動(dòng)員骨髓移植后表達(dá)突變的持續(xù)性激活c-kit小鼠的骨髓祖細(xì)胞。而且，小鼠體內(nèi)皮下注射AMD3100，Western-blotting 結(jié)果表明骨髓中c-kit 激酶的磷酸化活性降低，細(xì)胞流式分析表明CXCR4 減少。在細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中，把從小鼠中分離得到的骨髓祖細(xì)胞放在用血管

7、黏附分子（VCAM-1）處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SDF-1和SCF 增加c-kit 激酶的磷酸化活性，AMD3100抑制SDF-1介導(dǎo)的c-kit 激酶活性，但不能抑制SCF 介導(dǎo)的c-kit 激酶活性。還發(fā)現(xiàn)SDF-1介導(dǎo)的c-kit 激酶活性同時(shí)還需要激活Src 非受體型酪氨酸激酶：用選擇性Src 激酶抑制劑能阻斷c-kit 激酶的磷酸化活性以及c-kit與Src 激酶之間的相互作用。
　　 結(jié)論：上述結(jié)果表明SD

8、F-1/CXCR4在骨髓微環(huán)境中通過(guò)Src 調(diào)節(jié)c-kit 激酶活性,對(duì)骨髓祖細(xì)胞動(dòng)員起調(diào)節(jié)作用。
　　 第二部分CXCR4表達(dá)增多對(duì)于心肌來(lái)源的祖細(xì)胞在缺血的心臟的招募和駐留的調(diào)節(jié)
　　 目的：心肌缺血導(dǎo)致內(nèi)源性心肌祖細(xì)胞池迅速耗竭，通過(guò)注射外源性祖細(xì)胞的細(xì)胞治療方法因?yàn)橥庠葱孕募∽婕?xì)胞不能有效地被招募到缺血部位而受到限制。最近的報(bào)道表明基質(zhì)細(xì)胞趨化因子（SDF-1）及其受體CXC 趨化因子受體-4 （CXCR4）在招

9、募缺血介導(dǎo)的骨髓來(lái)源的循環(huán)干細(xì)胞中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，但是CXCR4在心肌祖細(xì)胞中的表達(dá)卻很低。因此，本實(shí)驗(yàn)研究缺氧對(duì)心肌祖細(xì)胞CXCR4表達(dá)的影響，經(jīng)缺氧預(yù)處理后的心肌祖細(xì)胞經(jīng)靜脈注射后招募到缺血組織的效率及在小鼠心肌缺血模型中對(duì)心功能的保護(hù)作用。方法和結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)缺氧預(yù)處理增加CXCR4在心肌來(lái)源的祖細(xì)胞（CLK:Cardiosphere-derived, Lin-/c-kit+progenitor cell）中RNA及蛋白水平的表達(dá)

10、；體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明缺氧后顯著地增加CLK細(xì)胞在體外的遷移，同時(shí)給予CXCR4小分子干擾RNA后能顯著阻斷此效應(yīng)；在小鼠心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭校o脈注射缺氧預(yù)處理與非缺氧預(yù)處理的CLK細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理后的CLK細(xì)胞能更多的被招募到缺血組織，術(shù)后四星期心肌梗死面積顯著減少，心功能顯著提高。而且，給予CXCR4 特異性抑制劑能明顯阻斷上述缺氧預(yù)處理后產(chǎn)生的效應(yīng)。體外細(xì)胞缺氧預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，CXCR4的增高依賴(lài)于缺氧誘導(dǎo)因子α（HIF-1α），