阿特拉津氯水解酶基因的遺傳轉(zhuǎn)化與定向改造研究.pdf

1、阿特拉津(atrazine)，化學(xué)名2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5三嗪，商品名莠去津，是一種世界范圍內(nèi)廣泛使用的三嗪類(lèi)除草劑，主要用于玉米、高粱、甘蔗、柑橘等抗阿特拉津作物田間闊葉雜草和禾草的防除。由于阿特拉津的使用量大、使用范圍廣、在土壤中降解速度緩慢（半衰期可長(zhǎng)達(dá)57周），已經(jīng)對(duì)土壤、地下水和地表水造成污染，在一些污染嚴(yán)重的地區(qū)，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)美國(guó)規(guī)定的3μg/L的最大允許值。近幾年研究表明，阿特拉津能引起兩棲動(dòng)物的生

2、殖缺陷；干擾哺乳動(dòng)物體內(nèi)性激素的分泌調(diào)節(jié)及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，造成繁殖異常和免疫系統(tǒng)紊亂；長(zhǎng)期接觸阿特拉津，可導(dǎo)致人類(lèi)卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病患病幾率增加。阿特拉津的廣泛使用，已經(jīng)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)健康造成極大的威脅，對(duì)阿特拉津污染環(huán)境的修復(fù)和治理是目前急需解決的實(shí)際問(wèn)題。
　　 阿特拉津氯水解酶(Atrazine ehlorohydralase，簡(jiǎn)稱(chēng)AtzA，E．C-3.8.1.8)能催化阿特拉津的水解脫氯反應(yīng)，使有毒的阿特拉

3、津變?yōu)闊o(wú)毒的羥基阿特拉津，對(duì)阿特拉津的生物降解和環(huán)境凈化有重要意義。
　　 將來(lái)源于假單胞菌(Pseudomonas sp.) ADP和節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.) AD1的阿特拉津氯水解酶基因atzA-ADP和atzA-AD1分別重組到植物表達(dá)載體pBin438上，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化進(jìn)煙草(Nicotiana tabacum L. cv.Samsun)中，通過(guò)煙草植株再生，共得到72株atzA-ADP轉(zhuǎn)化植株和6

4、4株atzA-AD1轉(zhuǎn)化植株?；蚪MPCR分別篩選得到42株轉(zhuǎn)atzA-ADP陽(yáng)性植株和38株轉(zhuǎn)atzA-AD1陽(yáng)性植株，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率分別為58.3％和59.4%。RT-PCR對(duì)篩選得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株檢測(cè)結(jié)果顯示，16株轉(zhuǎn)atzA-ADP陽(yáng)性植株和12株轉(zhuǎn)atzA.AD1陽(yáng)性植株中的atzA能夠在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。
　　 對(duì)其中3株檢測(cè)信號(hào)較強(qiáng)的轉(zhuǎn)atzA-ADP陽(yáng)性植株401、402、403和4株檢測(cè)信號(hào)較強(qiáng)的轉(zhuǎn)atzA-AD1陽(yáng)性

5、植株701、702、703、704的T1代進(jìn)行Southernblot分析顯示，atzA已經(jīng)整合到煙草基因組中并穩(wěn)定遺傳到后代。7株轉(zhuǎn)基因株系T1代種子經(jīng)150 mg/L阿特拉津處理后，發(fā)芽率比同樣濃度阿特拉津處理的野生型煙草種子高20%左右?；蚪MPCR對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因株系的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，atzA能夠在轉(zhuǎn)基因煙草株系基因組中穩(wěn)定遺傳。7株轉(zhuǎn)基因株系T2代植株在含2mg/kg阿特拉津的土壤中仍能正常生長(zhǎng)，其株高是經(jīng)同樣濃度阿特拉津處理的野生型

6、煙草植株的2.2-2.7倍，生物量是野生型的2.3-3.4倍；對(duì)轉(zhuǎn)基因株系及野生型煙草葉片中葉綠素含量測(cè)定結(jié)果顯示，經(jīng)阿特拉津處理的野生型煙草葉片中葉綠素含量較不加阿特拉津正常生長(zhǎng)的煙草植株下降了34%，而同樣濃度阿特拉津處理的轉(zhuǎn)基因株系葉片中葉綠素含量與不加阿特拉津處理時(shí)無(wú)明顯差異，表明阿特拉津?qū)D(zhuǎn)基因株系的光合系統(tǒng)沒(méi)有造成破壞。
　　 T2代轉(zhuǎn)基因煙草株系對(duì)土壤中阿特拉津的降解分析結(jié)果顯示，在含2mg/kg阿特拉津的土壤中培

7、養(yǎng)90d時(shí)，野生型株系的土壤中有74.1%阿特拉津殘留，而轉(zhuǎn)基因株系土壤中沒(méi)有檢測(cè)到阿特拉津殘留。說(shuō)明轉(zhuǎn)atzA煙草株系能夠?qū)ν寥乐懈邼舛劝⑻乩蜻M(jìn)行有效降解，在阿特拉津污染土壤的植物修復(fù)中具有很好的應(yīng)用潛力。
　　 盡管已經(jīng)從不同的細(xì)菌中獲得了atzA，但由于它們之間的同源性非常高，編碼酶的性能差異很小，因此限制和影響了該酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。對(duì)現(xiàn)有的基因進(jìn)行改造，不僅有望獲得酶活力大大提高的新酶，而且有助于對(duì)酶的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系進(jìn)行分析

8、。
　　 利用EP-PCR(錯(cuò)誤傾向PCR)和DNA shuffling(DNA洗牌或DNA重組)相結(jié)合的突變技術(shù)，對(duì)來(lái)源于假單胞菌ADP和節(jié)桿菌AD1的阿特拉津氯水解酶基因atzA-ADP和atzA-AD1進(jìn)行隨機(jī)突變，然后以雨生紅球藻為受體，以阿特拉津?yàn)楹Y選壓力對(duì)atzA突變文庫(kù)進(jìn)行篩選。本實(shí)驗(yàn)從0.5ug/mL（臨界濃度的5倍）阿特拉津篩選壓力下得到了7個(gè)突變子，7-10、15-1、16-1、21-1、40-8、48-6和

9、49-10;從1.0μg/mL（臨界濃度的10倍）阿特拉津篩選壓力下得到了5個(gè)突變子10-7、10-15、22-4、22-11和32-2。序列分析顯示，AtzA突變位點(diǎn)分散在全基因上，通過(guò)逐漸累積所形成，類(lèi)型以點(diǎn)替換為主。其中10-7/10-15、22-4/22-11、-40-8/-48-6/-49-10氨基酸突變位點(diǎn)相同。高壓液相色譜法分別檢測(cè)突變子對(duì)阿特拉津的酶活力，同時(shí)與野生型AtzA進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中添加1.0mg/L

10、阿特拉津時(shí)，22-4、10-7和21-1酶活力均為野生型的3倍以上，其余突變子相對(duì)活力介于1.8-2.3倍之間；培養(yǎng)液中添加2.0mg/L阿特拉津時(shí)，22-4、48-6、10-7、32-2、21-1和16-1酶活力均為野生型的2倍以上，15-1和7-10相對(duì)比活力分別為1.8倍和1.7倍；向含有3mg雨生紅球藻總蛋白的粗提液中加入0.6mg阿特拉津時(shí)，10-7、21-1、32-2、16-1、22-4和48-6酶活力均為野生型的2倍以上，