靶向miR-126慢病毒表達載體的構建及意義.pdf

1、研究目的：
　　檢測微小RNA-126(MicroRNA-126，miR-126)在CD4+CD25+調節(jié)性T細胞（regulatoryTcells，Tregs）中的表達水平，同時構建基于慢病毒的miR-126反義寡核苷酸序列(antisenseoligonucleotides，ASOs)表達載體，研究重組的病毒對Tregs外周誘導的作用，為進一步研究miR-126對Tregs的生物學功能的調控作用和機制奠定基礎。
　　研究

2、方法：
　　實時定量PCR特異性探針法檢測miR-126在Tregs中的表達水平;針對miR-126序列，設計合成其ASOs序列，退火后連接至經(jīng)AgeI酶和EcoRI酶雙酶切的pGCsil-LV-GFP載體上，連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，對經(jīng)PCR鑒定為陽性的載體（命名為pGCsil-miR-126-ASOs）進行測序分析;將構建成功的pGCsil-miR-126-ASOs表達質粒和pHelper1.0、pHelper2.0質

3、粒共轉染293T細胞，濃縮病毒顆粒并測定所獲病毒滴度;將制備好的病毒顆粒感染TGF-β體外誘導培養(yǎng)的小鼠CD4+CD62L+初始T細胞，72h后用流式細胞儀檢測其Foxp3的表達變化。
　　研究結果：
　　實時定量PCR結果顯示miR-126在Tregs中的表達明顯高于CD4+CD25-T細胞(P＜0.01);測序結果證明成功構建pGCsil-miR-126-ASOs重組質粒載體，包裝并獲得高濃度的慢病毒顆粒，病毒滴度為9×