重組炭疽疫苗免疫效應(yīng)的抗體組庫分析.pdf

1、疫苗對傳染性疾病的防控具有重要的意義，其發(fā)揮作用主要是通過接種抗原制劑激活獲得性免疫和形成免疫記憶，從而對特定病原體實現(xiàn)較長時間甚至終身的免疫。獲得性免疫包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩方面，其中抗體與抗原的相互作用是體液免疫發(fā)揮功能的基礎(chǔ)?？贵w（及其膜形式的B細(xì)胞受體）是體液免疫保護(hù)機體免受特定病原體損傷的關(guān)鍵分子，具有非常豐富的多樣性?？贵w多樣性的來源包括組合多樣性、連接多樣性和體細(xì)胞高頻突變?nèi)齻€方面。其中組合多樣性是指抗體可變區(qū)胚系基因之

2、間的隨機組合以及輕重鏈之間的組合具有豐富的可能性；連接多樣性是指抗體可變區(qū)三段（重鏈）或兩段（輕鏈）胚系基因之間不準(zhǔn)確的連接造成的多樣性；體細(xì)胞高頻突變是指已經(jīng)完成重排的抗體基因在抗原刺激后發(fā)生的高頻的點突變，其也會大大提高抗體的多樣性。如此豐富的多樣性使得抗體具備幾乎可以識別任何機體可能遇到的病原體的潛能。因此，對抗體及其分泌細(xì)胞或相應(yīng)記憶B細(xì)胞的分析是疫苗免疫效果評價的重要內(nèi)容之一。
　　目前考察體液免疫的響應(yīng)情況主要是采用酶

3、聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）、酶聯(lián)免疫斑點法（ELISPOT）等，這些方法雖然可以定性或定量地分析抗原特異性抗體、抗體分泌細(xì)胞以及記憶 B細(xì)胞的水平，但是不能從分子水平上了解所分析樣品中含有的特異性抗體序列為何，又有何特征等。因此，如何獲取抗體的序列信息，如何將特異性抗體從總的抗體組中篩選出來，成為亟待解決的問題。但是抗體豐富的多樣性給這類分析工作帶來了巨大的挑戰(zhàn)。
　　隨著高通量測序技術(shù)的進(jìn)步，其在越來越多的研究領(lǐng)域得到了應(yīng)用

4、。由于高通量測序技術(shù)能夠并行地獲取大量的序列信息，并借助相應(yīng)的生物信息學(xué)分析手段對這些序列信息進(jìn)行處理，因此非常適合研究抗體這類多樣性極其豐富的分子。利用高通量測序技術(shù)對抗體組進(jìn)行分析，即為抗體組庫技術(shù)。
　　目前，抗體組庫技術(shù)在感染性和自身免疫性疾病研究、免疫耐受機制探討、疫苗免疫效應(yīng)的觀察、抗體的篩選制備等方面都得到了應(yīng)用。本研究試圖利用抗體組庫技術(shù)分析基因工程重組炭疽疫苗免疫后的機體響應(yīng)情況，探索利用抗體組庫技術(shù)評價炭疽疫苗

5、免疫效應(yīng)的可行性，同時希望利用免疫效應(yīng)分析的結(jié)果指導(dǎo)特異性抗體的篩選和疫苗的優(yōu)化設(shè)計。
　　建庫是抗體組庫分析的基礎(chǔ)，因此本研究首先建立了利用基因特異性引物進(jìn)行建庫的方法。相比于其他建庫方法，基因特異性引物建庫的一般優(yōu)點在于操作簡單，建庫產(chǎn)物相對較短，利于后續(xù)的高通量測序，但存在可能會出現(xiàn)建庫偏性的缺點。本研究通過選擇合適的引物，避免了建庫偏性的問題，利用基因特異性引物建庫的結(jié)果與無偏性的建庫結(jié)果相比，三種鏈型之間的相關(guān)系數(shù)均在0

6、.65以上。這方便了后續(xù)工作的開展。
　　兩名志愿者接種了基因工程重組炭疽疫苗，并在28天后進(jìn)行了一次加免。同時在免疫前，首次免疫后第7天，第28天和第35天采集了志愿者的外周血單個核細(xì)胞。在利用 ELISA和毒素中和活性分析（TNA）確認(rèn)疫苗接種的有效性后，進(jìn)行建庫和高通量測序。
　　測序完成后，首先從抗體多樣性來源的角度對抗體組庫數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示：兩位志愿者之間及在不同時間點間的胚系基因使用頻率非常接近，使用頻

7、率最高的基因家族為重鏈V基因的1、3、4家族（＞83％），重鏈D基因的3家族（＞28%），重鏈J基因的4家族（＞45%），kappa鏈V基因的1、3家族（＞75%）， kappa鏈J基因的1、2、4家族（＞73%），lambda鏈V基因的1、2、3家族（＞70%）， lambda鏈J基因的3家族（＞44%），這與文獻(xiàn)報道也是一致的；兩位志愿者重鏈CDR3的平均長度為43個堿基，kappa鏈CDR3的平均長度為37個堿基，lambda鏈C

8、DR3的平均長度為31個堿基，且在不同時間點之間以及兩位志愿者之間均無統(tǒng)計學(xué)差異；兩位志愿者重鏈D基因三種讀碼框的比例以及三種鏈型中P-核苷酸和 N-核苷酸的數(shù)目分布在疫苗免疫前后同樣沒有顯著的變化；不同時間點之間三種抗體鏈的堿基突變率有所波動，但這種波動同免疫程序并無明顯關(guān)聯(lián)，這可能是由于志愿者在生活中接觸的環(huán)境抗原的復(fù)雜作用湮沒了疫苗特異性免疫效應(yīng)的信號。這說明，胚系基因使用頻率的分布情況，抗體互補決定區(qū)（CDR）3的組成情況，以及

9、氨基酸使用頻率的分布情況能夠保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，可以視作抗體組庫的固有特征；體細(xì)胞高頻突變情況雖然可以用來考察抗原的選擇壓力，但由于環(huán)境抗原作用過于復(fù)雜，因此體細(xì)胞高頻突變的情況不能直接反映疫苗的免疫效應(yīng)。
　　考慮到抗體的CDR3在抗原抗體相互作用中的重要性，我們又從 CDR3克隆的角度進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：高頻CDR3的CDR1 score和CDR2 score顯著地低于低頻CDR3的CDR1 score和CDR2 score

10、，體現(xiàn)了抗原選擇壓力對抗體組的塑造效果；高頻CDR3的CDR1 score和CDR2 score并不穩(wěn)定，但是其波動規(guī)律未顯示出與疫苗免疫流程的關(guān)聯(lián)；重鏈CDR3克隆的動態(tài)變化與疫苗免疫流程關(guān)系密切，在初次免疫后的第7天和加強免疫后的第7天（即第35天）新出現(xiàn)克隆所占的比例均超過了60%；kappa鏈和lambda鏈在這兩個時間點也存在激發(fā)出的新克隆，但響應(yīng)程度較低，第0天已經(jīng)存在的克隆占據(jù)著大約50%的比例；另外，考慮到已有研究指出B

11、細(xì)胞克隆的變化與14天后抗體滴度的變化存在正相關(guān)關(guān)系，重鏈CDR3克隆的收斂性與志愿者抗原特異性抗體的濃度存在著一致的變化趨勢。這表明，CDR3與CDR1或CDR2的配對關(guān)系可以用來考察抗原的選擇壓力，但由于環(huán)境抗原作用的復(fù)雜性，這種配對關(guān)系不能直接反映疫苗的免疫效應(yīng)；CDR3的動態(tài)變化與CDR3的收斂性能夠與抗原特異性抗體建立聯(lián)系，因此能夠用過來描述疫苗的免疫效應(yīng)。
　　這些結(jié)果實現(xiàn)了對抗體組庫變化特征的分類，同時也證明了利用抗

12、體組庫技術(shù)分析疫苗免疫效應(yīng)的可行性，為疫苗免疫效應(yīng)的描述補充了新的維度。
　　在對 CDR3的動態(tài)變化進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，綜合考慮 CDR3在單一時間點的靜態(tài)頻率及CDR3動態(tài)變化的信息，本研究建立了抗原特異性抗體克隆的篩選策略。利用 ELISA對篩選克隆的抗原結(jié)合能力進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，該策略對陽性克隆預(yù)測的準(zhǔn)確率達(dá)到了52%。
　　利用Discovery Studio4.5軟件和RCF（residue contact fr

13、equency）分析的算法對28株進(jìn)行抗原表位的預(yù)測，并利用ELISA從實驗角度驗證了抗體結(jié)合的抗原表位所在的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，24株有結(jié)合活性的抗體中，21株抗體的表位預(yù)測結(jié)果與用 ELISA測定的結(jié)果都是一致的。這說明本研究所用的表位預(yù)測方法是比較可靠的。結(jié)合TNA的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，這24株有結(jié)合活性的抗體中僅有3株顯示出了毒素中和活性。這說明本研究所篩選的高頻抗體多為非中和性抗體，即其識別的抗原表位多為非中和表位。這些結(jié)果為我們進(jìn)

14、一步對重組炭疽疫苗進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)提供了思路：削弱強勢的非中和表位的影響，加強中和表位的作用將有助于提高疫苗激發(fā)中和性抗體的效率，從而提高疫苗的保護(hù)效果。
　　綜上所述，本研究建立了抗體組庫分析的建庫方法，利用抗體組庫技術(shù)分析了基因工程重組炭疽疫苗免疫后機體的響應(yīng)情況，提出了評價疫苗免疫效應(yīng)的新指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，我們建立了陽性克隆的篩選策略，分析了抗原特異性抗體結(jié)合的抗原表位及其毒素中和活性，為疫苗的進(jìn)一步優(yōu)化提供了指導(dǎo)意見。這些工作