MT1-MMP基因敲除細(xì)胞誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系的構(gòu)建.pdf

1、目的：
　　 將外源性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和K1f4在體外轉(zhuǎn)染到成纖維細(xì)胞中,使其重新編程為具有胚胎干細(xì)胞樣狀態(tài)的細(xì)胞,這種細(xì)胞命名為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells,iPS)。iPS細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、增殖性、形成畸胎瘤、分化為三個(gè)胚層等方面與胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells,ESC)高度的相似,用病人特異性的iPS細(xì)胞進(jìn)行治療會(huì)避免發(fā)生免疫排斥反應(yīng),

2、同時(shí)也不會(huì)涉及損壞胚胎等倫理問題,為再生醫(yī)學(xué)的研究和臨床上進(jìn)行細(xì)胞移植治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)在血管形成中起著重要的作用,目前已發(fā)現(xiàn)有25種MMPs,他們有著相同的結(jié)構(gòu)以及相似的功能,但底物特異性是不同的?；|(zhì)金屬蛋白酶活性調(diào)節(jié)作用可發(fā)生在不同水平上,包括合成、分泌、激活和抑制。在血管形成過程中,降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的移行,形成管腔。膜型基質(zhì)金屬

3、蛋白酶(Membrane-typematrixmetalloproteinases,MT-MMPs)是一種跨膜蛋白,它含有MMPs所有特征性的蛋白結(jié)構(gòu)域,MT-MMP有六種亞型,MT1-MMP能夠降解各種細(xì)胞外基質(zhì),包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ膠原、纖連蛋白、纖維蛋白等,在血管和骨形成過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)將外源性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4在體外轉(zhuǎn)染進(jìn)入C57BL/6J和MT1-MMP基因敲除鼠的成纖維細(xì)胞中,使其

4、重新編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞,通過觀察該細(xì)胞形態(tài)、ES細(xì)胞特異性抗原的表達(dá)以及增殖分化能力鑒定iPS細(xì)胞。MT1-MMP-/-iPS細(xì)胞系的建立為研究MT1-MMP在血管及骨形成中的功能提供了一個(gè)良好的細(xì)胞模型。
　　 方法：
　　 1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將pMXs-Oct3/4、-Sox2、-c-Myc和-Klf4四種質(zhì)粒在大腸桿菌擴(kuò)增、提取;Plat-E細(xì)胞系包裝培養(yǎng)、收集上清液;提取C57BL/6J小鼠和MT1-MMP基因敲除

5、小鼠的成纖維細(xì)胞以密度8×104/ml細(xì)胞數(shù)接種于100mm的培養(yǎng)皿中,加入pMXs-Oct3/4、-Sox2、-c-Myc和-Klf4四種質(zhì)粒包裝成病毒的上清液,放入37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng),每天換液一次,兩天后接種到鋪有STO細(xì)胞的培養(yǎng)皿中,隔天換液。
　　 2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在光學(xué)倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的克隆形成情況,挑取克隆,傳代培養(yǎng),觀察iPS細(xì)胞的形態(tài)。
　　 3、堿性磷酸酶染色用堿性磷酸酶染色鑒

6、定iPS細(xì)胞。
　　 4、免疫熒光檢測用免疫熒光檢測iPS細(xì)胞的ES細(xì)胞特異性標(biāo)志SSEA-1和Oct3/4表達(dá)情況。傳代的iPS細(xì)胞,棄液、清洗、固定、透化、封閉后,同時(shí)加入SSEA-1和Oct3/4作為一抗,以PE標(biāo)記的IgG作為二抗,激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　 5、PCR檢測MT1-MMP在構(gòu)建的iPS細(xì)胞中的表達(dá)提取細(xì)胞的總DNA,PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照。
　　

7、 6、RT-PCR檢測Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的mRNA的表達(dá)提取細(xì)胞的總RNA,將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照。
　　 7、Westernblotting檢測MT1-MMP蛋白的表達(dá)提取細(xì)胞的總蛋白,用Westernblotting檢測細(xì)胞MT1-MMP蛋白表達(dá)情況。
　　 8、iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)用心肌和內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基將iPS細(xì)胞

8、以密度8×104/ml;懸滴法形成擬胚體后,向誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化,用細(xì)胞免疫熒光法檢測心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物肌鈣蛋白I和內(nèi)皮細(xì)胞早期特異性標(biāo)志物Flk-1表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察C57BL/6J和MT1-MMP基因敲除小鼠的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝好的Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的DNA,約兩周后形成細(xì)胞克隆,傳代后培養(yǎng)可見ES樣細(xì)胞克隆。
　　 2、堿性磷酸酶

9、染色傳代后的iPS細(xì)胞用堿性磷酸酶試劑盒進(jìn)行染色,可見穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞呈藍(lán)紫色。
　　 3、免疫熒光檢測傳代的iPS細(xì)胞明顯表達(dá)ES細(xì)胞特異性抗體SSEA-1和Oct3/4。
　　 4、C57BL/6J小鼠和MT1-MMP基因敲除小鼠的成纖維細(xì)胞以及兩種iPS細(xì)胞的分子生物學(xué)特征在MT1-MMP基因敲除小鼠的成纖維細(xì)胞和其形成iPS細(xì)胞中未見Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的表達(dá);而在兩種iPS細(xì)胞中,可見特征

10、性基因Oct3/4、Sox2、e-Myc和Klf4的表達(dá)。
　　 5、Westernblotting檢測MT1-MMP蛋白的表達(dá)C57BL/6J小鼠的成纖維細(xì)胞和其形成的iPS細(xì)胞有MT1-MMP蛋白的表達(dá),而MT1-MMP基因敲除小鼠的成纖維細(xì)胞及其iPS細(xì)胞中,沒有MT1-MMP蛋白的表達(dá)。
　　 6、體外iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)用心肌和內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基將iPS細(xì)胞懸滴法形成擬胚體后,接種于24孔板,約12天后,

11、向心肌細(xì)胞分化的擬胚體周圍出現(xiàn)跳動(dòng)區(qū)域。誘導(dǎo)的跳動(dòng)心肌細(xì)胞用免疫熒光可檢測到心肌特異性標(biāo)志物肌鈣蛋白I陽性表達(dá),分化的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)早期特異性標(biāo)志物Flk-1。
　　 結(jié)論：
　　 1、C57BL/6J小鼠和MT1-MMP基因敲除小鼠的成纖維細(xì)胞可重新編程為iPS細(xì)胞。
　　 2、MT1-MMP基因敲除小鼠的成纖維細(xì)胞重新編程的iPS細(xì)胞MT1-MMP蛋白表達(dá)缺失。
　　 3、重新編程的iPS細(xì)胞在體外可被