高糖損傷內(nèi)皮細(xì)胞及其與SelS和蛋白激酶C的關(guān)系.pdf

1、目的：觀察高糖和波動性高糖干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）后，上清液中丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活力的變化；蛋白激酶Cα(Protein kinase Cα，PKCα)、蛋白激酶Cβ2(Protein kinase Cβ2，PKCβ2)以及SelS在mRNA及蛋

2、白水平表達(dá)的差異。探討高糖對HUVECs的損傷是否通過PKC通路發(fā)揮作用，及此通路與SelS的關(guān)系，為研究內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)策略提供新的研究依據(jù)。
　　 方法：
　　 1．分別用含D-葡萄糖為5.5mM(Normal glucose group，NG)、20mM(Highglucose group，HG)、5.5mM與20mM隔日交替(Intermittent glucose group，IG)及含14.5 mM甘露醇(Man

3、nitol group，MG)培養(yǎng)液中孵育HUVECs2天、7天以及14天，觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，取各組細(xì)胞上清液，用硫代巴比妥酸法測定MDA的含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活力。
　　 2．按照方法1干預(yù)HUVECs，分別于2天、7天、14天后提取各組細(xì)胞總RNA，采用實時定量PCR的方法測定各組細(xì)胞的SelS及PKCα、PKCβ2在mRNA水平的表達(dá)。
　　 3．按照方法1干預(yù)HUVECs，分別于2天、7天、14

4、天后提取各組細(xì)胞總蛋白，采用Western blot的方法檢測SelS及PKCα、PKCβ2在蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1．細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：細(xì)胞分別暴露于含不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2天后，在倒置顯微鏡下觀察，NG和MG細(xì)胞輪廓清晰，多呈梭形，胞質(zhì)胞核清晰可見；HG細(xì)胞輪廓尚清楚，胞質(zhì)增多，胞體增大，呈鋪路石樣，IG細(xì)胞形態(tài)與高糖組相似；7天后，NG和MG細(xì)胞形態(tài)與2天基本相同，HG細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞輪

5、廓模糊不清，胞質(zhì)明顯增多，胞體細(xì)長，呈枯樹枝樣，IG細(xì)胞變化更加明顯；14天后，NG和MG細(xì)胞形態(tài)良好，HG細(xì)胞數(shù)量減少更加明顯，IG細(xì)胞變化較HG更加明顯。
　　 2．MDA含量（nmol/ml）：干預(yù)2天后，HG(5.15±0.32)和IG(5.17±0.14)分別與NG(1.10±0.20)和MG(1.12±0.17)相比，MDA含量顯著升高(P=0.004,P=0.003;P=0.002,P=0.003),HG與IG相比

6、無顯著差異(P＞0.05)；干預(yù)7天后，HG(8.44±0.44)和IG(10.86±0.36)較NG(1.07±0.15)和MG(1.09±0.14)MDA含量顯著升高(P=0.008,P=0.004;P=0.003,P=0.003),且IG比HG升高更加明顯(P=0.002);干預(yù)14天后，HG(11.92±0.38)和IG(15.66±0.56)分別與NG(1.18±0.21)和MG(1.15±0.20)相比，MDA含量顯著升高(

7、P=0.006,P=0.005;P=0.004,P=0.003),且IG比HG升高更加明顯(P=0.003)。各時間段，NG和MG相比都無明顯差異(P＞0.05)。隨著時間的延長，HG和IG組MDA含量7天較2天明顯升高(P=0.006;P=0.003),14天較7天顯著升高(P=0.004，P=0.002)。
　　 3．SOD活力(U/ml):干預(yù)2天后，HG(27.76±0.40)和IG(26.45±0.49)分別與NG(3

8、4.41±1.05)和MG(34.32±0.98)相比，SOD活力顯著降低(P=0.003,P=0.002:P=0.00,P=0.00),HG與IG相比無顯著差異(P＞0.05)；干預(yù)7天后，HG(20.27±0.52)和IG(16.29±0.38)較NG(34.33±1.04)和MG(34.40±0.99)SOD活力顯著減弱(P=0.006,P=0.004;P=0.003,P=0.002),且IG比HG降低更明顯(P=0.002)；干

9、預(yù)14天后，HG(10.36±0.45)和IG(5.81±0.45)分別與NG(34.33±1.04)和MG(34.33±0.95)相比，SOD活力顯著降低(P=0.004,P=0.003;P=0.002,P=0.005),且IG比HG降低更明顯(P=0.001)。不論2天，7天還是14天，NG和MG相比都無差異(P＞0.05)。隨著時間的延長，HG和IG組SOD活力7天較2天明顯降低(P=0.008,P=0.004),14天較7天顯著

10、降低。
　　 4．SelS mRNA的表達(dá)：干預(yù)2天后，HG(0.80±0.03)和IG(0.87±0.05)與NG(0.71±0.02)和MG(0.72±0.03)相比，SelS mRNA表達(dá)顯著升高(P=0.01,P=0.002;P==0.006,P=0.001),且IG高于HG(P=0.03)；干預(yù)7天后，HG(0.95±0.08)和IG(1.09±0.03)較NG(0.82±0.04)和MG(0.82±0.02)SelS

11、 mRNA表達(dá)顯著升高(P=0.01,P=0.00;P=0.002,P=0.004),且IG比HG升高更加明顯(P=0.01)；干預(yù)14天后，HG(1.07±0.03)和IG(1.16±0.02)分別與NG(0.91±0.03)和MG(0.90±0.03)相比，SelS mRNA表達(dá)顯著升高(P==0.008,P==0.004;P=0.003,P=0.003),且IG比HG升高更加明顯(P=0.003)。隨著時間的延長，HG和IG組Se

12、lS mRNA的表達(dá)7天較2天明顯升高(P=0.02,P=0.03),14天較7天顯著升高(P=0.03,P=0.046)。
　　 5．SelS蛋白水平的表達(dá)：干預(yù)2天后，HG(0.51±0.02)和IG(0.58±0.04)分別與NG(0.37±0.05)和MG(0.36±0.03)相比，SelS在蛋白水平的表達(dá)明顯升高(P=0.02，P=0.00;P=0.00，P=0.00)，且IG高于HG(P=0.04);干預(yù)7天后，HG

13、(0.63±0.02)和IG(0.75±0.03)較NG(0.53±0.05)和MG(0.53±0.02)明顯升高(P=0.006，P=0.004;P=0.003，P=0.002)，且IG比HG升高明顯(P=0.002)；干預(yù)14天后，HG(0.85±0.03)和IG(1.01±0.04)分別與NG(0.56±0.05)和MG(0.55±0.04)相比，SelS在蛋白水平的表達(dá)顯著升高(P=0.004，P=0.003；P=0.002，P

14、=0.005)，且IG比HG升高更加明顯(P=0.003)。隨著時間的延長，HG和IG組SelS在蛋白水平的表達(dá)7天較2天明顯升高(P=0.02，P=0.03)，14天較7天顯著升高(P=0.03，P=0.04)。
　　 6．PKCαmRNA和蛋白水平的表達(dá)：各時間段、各組PKCα mRNA和蛋白水平的表達(dá)均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 7.PKCβ2 mRNA水平的表達(dá)：干預(yù)2天后，HG(1.05±0.03)和

15、IG(1.12±0.03)分別與NG(0.97±0.05)和MG(0.97±0.05)相比，PKCβ2 mRNA表達(dá)明顯升高(P=0.03，P=0.00;P=0.003，P=0.003)，且IG高于HG(P=0.04);干預(yù)7天后，HG(1.11±0.02)和IG(1.21±0.01)較NG(0.95±0.07)和MG(0.96±0.05)均顯著升高(P=0.00，P=0.008;P=0.004;P=0.003)，且IG比HG升高明顯(

16、P=0.03)；干預(yù)14天后，HG(1.18±0.03)和IG(1.28±0.04)分別與NG(0.97±0.07)和MG(0.95±0.03)相比，PKCβ2 mRNA表達(dá)明顯升高(P=0.01，P=0.00;P=0.002，P=0.004)，且IG比HG升高更加明顯(P=0.02)。
　　 8．PKCβ2蛋白水平的表達(dá)：干預(yù)2天后，HG(0.56±0.03)和IG(0.65±0.04)分別與NG(0.47±0.04)和MG(

17、0.48±0.06)相比，PKCβ2在蛋白水平的表達(dá)明顯升高(P=0.04，P=0.00;P=0.003，P=0.002)，且IG高于HG(P=0.03);干預(yù)7天后，HG(0.74±0.03)和IG(0.83±0.02)較NG(0.49±0.03)和MG(0.48±0.07)顯著升高(P=0.006，P=0.005;P=0.003，P=0.004)，且IG高于HG(P=0.03)；干預(yù)14天后，HG(0.85±0.03)和IG(1.0

18、1±0.05)分別與NG(0.48±0.06)和MG(0.48±0.04)相比，其蛋白水平明顯升高(P=0.01，P=0.002;P=0.002，P=0.004)，且IG比HG升高更加明顯(P=0.03)。
　　 結(jié)論：
　　 1．恒定和波動高糖均可通過氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮，波動高糖的損傷作用更明顯；并有時間依賴性，控制血糖不僅著眼于持續(xù)高糖，更重要的是控制波動高糖及早期干預(yù)。
　　 2．高糖對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷可能與P