轉(zhuǎn)基因CTGF和TIMP1髓核細(xì)胞移植阻逆兔腰椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]椎間盤退變是引起腰背痛的主要原因，尋找延緩或阻逆椎間盤退變的有效方法被認(rèn)為是非常有意義的嘗試。為此，我們?cè)谖?chuàng)CT引導(dǎo)穿刺建立兔椎間盤退變模型的基礎(chǔ)上，將腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)介導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissueinhibitor of metalloproteinases1，TI

2、MP1)雙基因體外聯(lián)合轉(zhuǎn)染兔椎間盤髓核細(xì)胞后，再將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植于退變兔腰椎間盤內(nèi)，不同時(shí)期分別觀察椎間盤信號(hào)、椎間高度、Ⅱ型膠原和蛋白多糖合成的變化，以探討體外延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤細(xì)胞退變的方法。
　　 [方法]63只新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)用兔，其中60只應(yīng)用CT引導(dǎo)下的微創(chuàng)穿刺法建立兔椎間盤退變模型：選擇L2-3、L3-4、L4-5椎間盤層面進(jìn)行CT掃描以穿刺，L1-2、L5-6椎間盤不穿刺作為對(duì)照組。以左后方為進(jìn)針點(diǎn)，測(cè)量穿刺角度

3、及深度。消毒后在CT定位下，經(jīng)皮以18G的穿刺針由右后方穿刺腰椎間盤。穿刺針尖接近纖維環(huán)時(shí)行CT掃描，調(diào)整穿刺角度。刺入髓核腔后再次CT掃描，確定針尖位于髓核中央。造模2周后行MRI掃描以檢查椎間盤退變狀況。另外3只細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)取椎間盤用。rAAV2-CTGF-TIMP1按每個(gè)細(xì)胞10-6個(gè)病毒顆粒與適量的無血清HAMF12/DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液混合，將上述混合液加入PBS緩沖液洗過的二代髓核細(xì)胞中以轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用上述微創(chuàng)穿刺法，選取L2-

4、3、L3-4、L4-5退變椎間盤，以32G穿刺針穿入髓核內(nèi)，將22μ l的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞懸液緩緩注射于椎間盤內(nèi)作為細(xì)胞移植組；退變椎間盤內(nèi)注入磷酸鹽緩沖液(。PBS)作為退變對(duì)照組；正常椎間盤作為空白對(duì)照組。
　　 分別于6、10、14周行X線觀察椎間高度的變化、測(cè)定并比較％DHI；行MRI檢查以觀查椎間盤信號(hào)的改變；HE染色、Safranine0染色及Masson染色觀察轉(zhuǎn)基因前后椎間盤組織變化；免疫組化染色觀察髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原的

5、表達(dá)；Western-blot鑒定細(xì)胞因子CTGF和TIMP1在椎間盤內(nèi)的表達(dá)；35S整合法測(cè)定兔髓核組織蛋白多糖合成率；RT-PCR檢測(cè)Ⅱ型膠原及蛋白多糖mRNA的表達(dá)。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS15.0進(jìn)行方差分析和多樣本均數(shù)兩兩比較。P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]CT引導(dǎo)下經(jīng)皮微創(chuàng)穿刺法具有創(chuàng)傷小、操作安全等優(yōu)點(diǎn)，MRI證實(shí)穿刺2周后椎間盤開始退變，該方法為建立兔椎盤退變模型新的有效方法。腺相關(guān)病毒(AAV)

6、可高效轉(zhuǎn)染兔髓核細(xì)胞并快速介導(dǎo)目的基因的表達(dá)。X線檢查示6，10，14周后退變對(duì)照組％DHI明顯低于細(xì)胞移植組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示細(xì)胞移植組椎間高度較對(duì)照組得以維持。MRI證實(shí)，隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，退變對(duì)照組椎間盤退變呈進(jìn)行性加重。在6、10周、14周，依據(jù)改良Thompson法分級(jí)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植組和退變對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HE染色示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植后髓核內(nèi)細(xì)胞較多，分部較均勻：Safrani

7、ne0染色證實(shí)轉(zhuǎn)基因后髓核細(xì)胞蛋白多糖表達(dá)明顯增多；Masson染色觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植后，椎間盤的退變延緩明顯。Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果示轉(zhuǎn)基因后兔髓核細(xì)胞合成分泌Ⅱ型膠原能力較前有所增加，細(xì)胞移植組和退變對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植后Western-Blot檢測(cè)6周、10周及14周時(shí)細(xì)胞因子在椎間盤內(nèi)的表達(dá)結(jié)果顯示：CTGF均有陽性表達(dá)，而TIMP1在6周及10周時(shí)有陽性表達(dá)，在14周時(shí)表達(dá)則明顯減

8、弱，提示CTGF在體內(nèi)椎間盤的表達(dá)更具有持久性。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植后第6周，10周及14周，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)檢測(cè)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)，細(xì)胞移植組和退變對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白對(duì)照組和和退變對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞移植組和空白對(duì)照組相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植后第6周，10周及14周，應(yīng)用5S整合法檢測(cè)檢測(cè)蛋白多糖的合成率，細(xì)胞移植組和空白對(duì)照組分別

9、與退變對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞移植組和空白對(duì)照組相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 [結(jié)論]微創(chuàng)經(jīng)皮CT引導(dǎo)下穿刺椎間盤可成功建立兔椎間盤退變模型。腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的CTGF和TIMP1可以在兔髓核細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。體外轉(zhuǎn)雙基因CTGF和TIMP1髓核細(xì)胞再行體內(nèi)移植后，可有助于椎間高度的維持，促進(jìn)椎間盤正常MRI信號(hào)的恢復(fù)。免疫組化、RT-PCR及5S整合法均證實(shí)轉(zhuǎn)雙基因細(xì)胞移植可明顯促進(jìn)退變