尸體肝組織時(shí)序性降解產(chǎn)物推斷死亡時(shí)間的研究.pdf

1、背景：
　　死亡時(shí)間(Postmortem interval,PMI)推斷一直是法醫(yī)學(xué)研究和實(shí)踐中的重點(diǎn)和難點(diǎn)課題，如何快速、準(zhǔn)確、方便的推斷PMI，對(duì)于死亡案件犯罪嫌疑人的排查、偵破，以及醫(yī)療糾紛和財(cái)產(chǎn)繼承等司法審判，均具有重要意義。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已應(yīng)用各種方法，力圖實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、可靠和實(shí)用地推斷PMI，但是，這些研究大多局限于單一尸體變化現(xiàn)象或單一物質(zhì)的死后時(shí)序性變化的檢測(cè)，尚未獲得公認(rèn)的可實(shí)際應(yīng)用突破性進(jìn)展。
　　機(jī)體死后

2、各器官組織細(xì)胞的新陳代謝停止，失去整體調(diào)控和局部代謝平衡的活體內(nèi)外理化環(huán)境，細(xì)胞溶酶體的水解酶、胃腸道及消化腺的消化酶和消化液，以及體內(nèi)腐敗菌和體外昆蟲(chóng)等相互作用，形成了復(fù)雜的尸體內(nèi)外理化環(huán)境，綜合導(dǎo)致尸體組織發(fā)生自溶、腐敗、風(fēng)化的宏觀時(shí)序性變化過(guò)程。其本質(zhì)為組織細(xì)胞中結(jié)合的和游離的生物大分子持續(xù)性降解，及其混雜腐敗微生物和嗜尸性昆蟲(chóng)的消化性代謝的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，即蛋白質(zhì)、核酸、脂類和碳水化合物等生物大分子-有機(jī)中分子-有機(jī)小分子-無(wú)

3、機(jī)中分子-無(wú)機(jī)小分子-離子和元素的單向性降解或水解過(guò)程。這種生物尸體“回歸自然”的降解代謝過(guò)程，存在著與活體生長(zhǎng)代謝生化基本原理相應(yīng)的“逆向反應(yīng)”規(guī)律性。因此，基于高通量和超微量的生物組織代謝物定性定量檢測(cè)和組群指標(biāo)數(shù)據(jù)分析的代謝組學(xué)理論及技術(shù)，完全適用于研究尸體組織化學(xué)變化規(guī)律，及其時(shí)序性降解代謝路徑中與PMI相關(guān)的物質(zhì)組合圖譜和標(biāo)志物，既相對(duì)獨(dú)立又相互重疊的最佳“窗口期”，用于從個(gè)體死亡開(kāi)始至白骨化的尸體變化全程不間斷精確推斷PMI

4、。
　　本研究是在“利用組織生物力學(xué)性狀時(shí)序性變化推斷死亡時(shí)間”的前期實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)尸體組織經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化定時(shí)、定位、定形、定量的取材之后，常規(guī)福爾馬林溶液定比和定時(shí)固定的“六定”萃取液，肉眼觀固定液的顏色和渾濁度呈時(shí)序性加深的規(guī)律，提示死后不同時(shí)間尸體組織自溶腐敗的時(shí)序性產(chǎn)物，可被福爾馬林溶液萃取，進(jìn)而通過(guò)各種先進(jìn)的物質(zhì)理化定性定量?jī)x器，進(jìn)行與PMI相關(guān)代謝物的指紋圖譜和代謝輪廓分析。因此，擬采用紫外-可見(jiàn)分光光度法(ultravio

5、let and visible spectropHotometry,UV-VIS)分析家豬及人尸體肝組織不同PMI“六定”固定-萃取液的色度、成分及其含量的變化，探討肝組織自溶腐敗過(guò)程的時(shí)序性量變和質(zhì)變規(guī)律，篩選推斷PMI最佳指標(biāo)。
　　目的：
　　1、建立恒溫恒濕條件下家豬肝組織死后變化模型，標(biāo)準(zhǔn)化“六定”取材和常規(guī)福爾馬林固定-萃取液，UV-VIS檢測(cè)液體的色度、成分及其含量變化與PMI的相關(guān)性。
　　2、隨時(shí)獲得

6、已知死亡時(shí)間的人尸體肝組織檢材，標(biāo)準(zhǔn)化“六定”取材不同 PMI的檢材，及其和固定-萃取液，結(jié)合死因和環(huán)境溫度因素，初步探討尸體組織代謝組學(xué)的理論和技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際人尸體，推斷PMI的可行性。
　　方法：
　　1、屠宰場(chǎng)健康成年家豬肝臟7例，放置溫度25℃-濕度70(±5)％恒溫箱保存，按照標(biāo)準(zhǔn)化“六定”取材方案：①定時(shí)，按0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、12

7、0h、132h、144h、156h時(shí)間點(diǎn)取材7例/組；②定位，肝右葉裸區(qū)中部，避開(kāi)被膜、肝門及較大血管和膽管；③定量，每樣本切取5g；④定型，肝組織成型階段，切取近立方體狀，以使其表面積基本均等；⑤定比，前“四定”取材樣本，均按1:10質(zhì)量-溶液比固定于10%蒸餾水-甲醛液(1:10配制)，即10%福爾馬林固定液50ml；⑥定期，同時(shí)以固定液兼萃取液放置72h后，單層濾紙過(guò)濾固定-萃取液40ml，即“六定”取材備用。
　　2、深圳

8、市公安局技術(shù)處法醫(yī)檢驗(yàn)中心2011年3月-7月明確PMI不同死因男性尸體23例，18～40周歲，均-5℃±3℃冰柜冰凍數(shù)小時(shí)～數(shù)月，室溫解凍后，常規(guī)尸檢取肝，室溫保濕放置，按0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、156h、168h、180h、192h時(shí)間點(diǎn)，同上標(biāo)準(zhǔn)化“六定”取材備用，
　　3、取材前觀察記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝組織大體形態(tài)學(xué)變化

9、，拍照后選擇顏色分布均勻的3個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域選取5個(gè)點(diǎn)，計(jì)算機(jī)取色軟件檢測(cè)RGB顏色色值。萃取液直接紫外-可見(jiàn)光分光光度儀色度檢測(cè)和pH儀測(cè)定酸堿度；提取5ml萃取液，5000r/m離心5min，取上清液，蒸餾水32倍稀釋后，紫外-可見(jiàn)光分光光度儀定性定量掃描分析。
　　結(jié)果：
　　1、肉眼觀家豬肝組織大體顏色的時(shí)序性變化，0-18h暗紅色、24-30h火磚色、36-72h褐玫瑰紅色、84-108h亮灰色、120-156h灰

10、色。計(jì)算機(jī)取色軟件測(cè)定的各時(shí)間點(diǎn)肝組織大體照片RGB顏色色值，隨PMI呈0-84h時(shí)序性上升，84-120h時(shí)序性下降，與PMI相關(guān)性YR=-0.168X2+25.27X+23.46(R2=0.940),YG=-1.294X2+29.25X+-9.597(R2=0.927),YB=-1.095 X2+26.82X+-8.685(R2=0.923)；132-156h呈“平臺(tái)期”。
　　2、紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，結(jié)合鉻鈷比色法，可見(jiàn)

11、光區(qū)測(cè)得家豬肝組織”六定”固定-萃取液色度(Abs350nm)隨著PMI延長(zhǎng)的時(shí)序性上升趨勢(shì)，與PMI呈近似直線正相關(guān)， Y=42.643X-17.525/R2=0.987（p<0.05），精確度達(dá)12h。
　　3、紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，1100-190nm范圍全波長(zhǎng)掃面，家豬和人肝組織的固定-萃取液均在紫外光區(qū)268(±10)nm波段，出現(xiàn)穩(wěn)定的吸收峰，峰位、峰形及其他波段雜峰均基本相同。Abs268(±10)nm值隨PMI延

12、長(zhǎng)呈時(shí)序性上升趨勢(shì)。在0h-120h期間，家豬肝組織Abs268(±10)nm隨 PMI呈近似線性正相關(guān)，Y=0.062X+0.079/R2=0.961（p<0.05），精確度達(dá)12h；120h后變化趨勢(shì)不明顯呈“平臺(tái)期”表現(xiàn)；人肝組織Abs268(±10)nm值隨PMI延長(zhǎng)，逐漸升高的趨勢(shì)，死后30h內(nèi)，與PMI呈近似直線正相關(guān)，Y=0.012X+0.119/R2=0.812。
　　4、家豬肝組織固定-萃取液均呈酸性，其中，0h

13、-120h時(shí)間段，pH值隨PMI延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，與PMI呈近似線性負(fù)相關(guān)，Y=-0.087X+4.454/R2=0.931(p<0.05)，精確度達(dá)12h,；120h以后pH值變化趨勢(shì)不明顯，呈“平臺(tái)期”表現(xiàn)。
　　5、不同死因情況下，人尸體肝組織固定-萃取液 Abs268(±10)nm值存在一定差異性。相同溫度(25℃)下，失血性休克死與捂壓口鼻機(jī)械性窒息死比較，肝組織各時(shí)間點(diǎn)Abs268(±10)nm值，失血性休克死均高于窒息

14、死，差異顯著P<0.05，二者PMI相差55-56.5h；而相同死因的，各時(shí)間點(diǎn)Abs268(±10)nm值差異無(wú)顯著性P>0.05。
　　不同環(huán)境溫度情況下，4月份25℃和7月份30℃的失血性休克死者，相同時(shí)間點(diǎn)Abs268(±10)nm值7月組高于4月組，差異顯著P<0.05，二者PMI上相差1-16h。4月和6-7月份窒息死者，相同時(shí)間點(diǎn)Abs268(±10)nms值6-7月組高于4月組，差異顯著P<0.05，二者PMI上相

15、差35-58h。
　　結(jié)論：
　　1、借助計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)讀取肝組織大體照片的RGB顏色色值，可提高分辨率，替代傳統(tǒng)的色澤主觀定性表述，較精細(xì)量化地測(cè)定色值，獲得與PMI相關(guān)的客觀量化數(shù)理公式，用于規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)化地推斷PMI。
　　2、尸體組織自溶腐敗風(fēng)化的死后降解代謝及其產(chǎn)物的時(shí)序性變化與PMI之間存在明顯的正相關(guān)性，適用代謝組學(xué)理論和技術(shù)，獲得相關(guān)推斷PMI理化公式；不同死因和環(huán)境溫度可明顯地影響尸體組織自溶腐敗的時(shí)序性

16、降解生物化學(xué)過(guò)程。
　　3、規(guī)范化“六定”取材，特別是常規(guī)福爾馬林液可作為尸體組織標(biāo)本的固定兼萃取液，直接或進(jìn)一步分離提取液，可進(jìn)行尸體組織代謝組學(xué)檢測(cè)；在死后120h內(nèi)，肝組織固定-萃取液的色度和Abs268(±10)nm值，均隨PMI延長(zhǎng)呈明顯時(shí)序性上升趨勢(shì)，pH值隨PMI延長(zhǎng)呈明顯時(shí)序性下降趨勢(shì)，可作為推斷PMI的科學(xué)準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單量化新方法，亦可與其他尸體組織代謝組學(xué)的指標(biāo)，相互結(jié)合地更準(zhǔn)確滴推斷PMI；
　　4、人和豬