東北白樺COMT1和CESA4基因克隆及反義COMT1遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、木質(zhì)素(lignin)是酚類多聚體，在植物體內(nèi)含量?jī)H次于纖維素。木質(zhì)素在維管植物細(xì)胞壁的木質(zhì)化，機(jī)械組織的形成和植物抗病等方面有著重要作用?？Х人?5-羥基阿魏酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeic acid-O-methy ltransferase，COMT)是木質(zhì)素單體合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一，催化咖啡酸、5-羥基松柏醛和5-羥基松柏醇甲基化分別生成阿魏酸、芥子醛和芥子醇，參與S-木質(zhì)素的合成。目前，一些植物中COMT基因被克隆報(bào)道。

2、在東北地區(qū)一個(gè)重要林木——東北白樺中，COMT和CESA4基因信息以及COMT在白樺樹種中參與木質(zhì)素代謝作用未見報(bào)道。
　　本研究利用其它植物COMT1以及CESA4基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過RT-PCR分離出東北白樺COMT1部分cDNA片段852bp，用這段已知cDNA片段設(shè)計(jì)引物，結(jié)合RACE技術(shù)克隆出東北白樺COMT1基因cDNA序列1367bp，其中完整編碼區(qū)長(zhǎng)度為1095bp，編碼365個(gè)氨基酸，GenBank上注

3、冊(cè)號(hào)為KC292201。氨基酸同源性比對(duì)顯示，東北白樺COMT1與陸地棉、毛果楊、赤桉以及歐洲白樺的COMT同源性分別為79.2％、79.2％、77.2％、99.5％。利用同樣技術(shù)方案，我們克隆出東北白樺CESA4基因cDNA序列3231 bp，其中完整編碼區(qū)長(zhǎng)度為3150bp，編碼1049個(gè)氨基酸。同源性比對(duì)表明，東北白樺CESA4與光皮樺和歐洲白樺CESA4同源性分別為98.6％和99.7％。
　　利用Gateway技術(shù)分別構(gòu)

4、建了東北白樺COMT1植物過量表達(dá)和反義表達(dá)載體，將構(gòu)建的pGWB2-antiCOMT1反義植物表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，采用葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化東北白樺，得到11個(gè)轉(zhuǎn)反義COMT1基因的東北白樺轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)轉(zhuǎn)反義COMT1轉(zhuǎn)基因東北白樺植株中COMT1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析顯示，轉(zhuǎn)基因植株中COMT1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與野生型（未轉(zhuǎn)基因植株）相比均明顯降低，此外，COMT1基因轉(zhuǎn)錄在不同轉(zhuǎn)基因株間被降低程度強(qiáng)弱不同。我們的這些結(jié)果表明，遺傳轉(zhuǎn)化反義COM